CRISPR / CAS9在生物过程中的应用和影响

在这张播客中,我们与无锡生物制剂专家进行了小组讨论,该专家了解过去十年的巨大技术进步之一,CRISPR / CAS9技术。我们讨论了该技术的潜力,特别是在生物制药的发现和发展中的可能性。我们还对其对生物处理和生物制造的潜在影响进行了深入的潜水。

播客笔记:

细胞系发育和蛋白质科学主任风林王先生通过将CRISPR / CAS9作为分子生物学基因编辑工具提供背景来开始播客。她解释说,CRISPR / CAS9基因编辑系统适应自然原核防御机制对噬菌体。为了简化,CRISPR / CAS9系统一旦掺入细菌基因组中,就会切割噬菌体DNA以保持噬菌体再现。CRISPR是一种代表“定期间隙的短语重复的集群”的首字母缩写,CAS9是该基因编辑功能中使用的CAS核酸类的最良好研究的变体。研究界改编了这种机制,彻底改变了遗传修饰如何在原核和真核细胞中进行。

接下来,我向企业发展总监Zane Starkewolfe询问了CRISPR / CAS的起源。他分享了该研究可以在CRISPR中找到,这些克里普尔特可以追溯到20世纪80年代后期,其他工作在2000年代的第一个十年中进行。但是,2012年,在期刊上发表了两份关键的研究论文科学,UC Berkeley的Jennifer Doudna jennifer Doudna和维也纳大学的Emmanuelle Charpentier,然后是另一个pnas.由Vilnius大学的Viedrius Gasiuunas的ViedriusGasikšnys实验室。所有这些论文都证明使用细菌CRISPR / CAS9作为一种简单,可编程的基因编辑工具。He went on to say that in less than a year, the labs of Dr. Feng Zhang of the Broad Institute at MIT, and Dr. George Church’s lab at Harvard, reported success in adapting CRISPR/Cas9 for genome editing in eukaryotic cells in both mouse and human cells.

然后,我问Zane为什么有关于使用CRISPR作为分子生物学工具的兴奋。他描述了CRISPR的非凡功能是它允许科学家们在生物体的遗传密码内瞄准特定位置,以切出或替换DNA的一段。由于该效用的特异性和精确性,应用具有深远的潜力。因此,它已经成为许多生命科学领域的分子工具箱游戏更换器,因为它能够高效,经济高效,精确的基因编辑,具有宽的生物治疗方法,包括细胞和基因治疗,疾病建模,诊断,农业,工业生物学等等。

然后我们讨论了比其他基因编辑系统更好的内容。Zane表示,今天使用的许多其他基因编辑系统如锌手指核酸酶,Talens,使用Meganucl酶或病毒载体等像AAV,与CRISPR / CAS9相比是非常复杂和时间密集的。他们经常需要更多的步骤并且更昂贵。此外,CRISPR / CAS9具有低“偏离目标”效果曲线,再次使其成为理想的基因编辑工具。

我要求Zane用CRISPR技术描述最近的一些进步。他说,进步是广泛且正在进行的。他分享的一个例子是Crispra和Crispri1,这是使用“死Cas9”来上下调节的技术升级的基因表达。死Cas9去除Cas9的核酸酶能力,但仍然可以使用高度特异性的单引导RNA来允许靶向结合,其使用高度特异的单引导RNA是Crispr基因组编辑的基石之一。

Fenglin补充说,另一个应用程序正在使用CRISPR用于同源的​​定型修理或HDR。这种技术以简单的术语修理双链DNA断裂。这对于基因组稳定性很重要。CRISPR介导的HDR可用于修复突破,也可以产生突破,然后用小突变或其他较大序列替换它。这些技术基本上开启了研究人员能够快速有效地制作基因组编辑的能力。

接下来,我询问了CRISPR的可扩展性。Zane解释说,全球的研究人员正在使用单引导RNA的库来发现新药物目标并开发快速诊断,包括使用它在对阵Covid-19的斗争中,以及其他应用阵列。

我问丰林关于克里普尔克在生物制药发展中的应用。她谈到了通过修饰或删除产品基因本身的序列来利用分子的成功来讨论苛刻的方法,以优化其预期治疗目的。特别是特殊的病毒疫苗,CRISPR可用于编辑编码病毒的蛋白质涂层或膜的基因,以提供更大的免疫应答或减少副作用体内。另外,如提到的,也可以作为蛋白质表达或参与蛋白质产物的后转化修饰所涉及的基因的上下调节。

我通过询问如何开始提高这些改进来跟进。她说要这样做,我们只是需要了解如何改进的地方。今天大多数科学家都有优势,与过去几年来说,知道CRISPR在他们的分子工具箱中以快速且容易地改变这些变化。因此,可以比以往任何时候的比较更快地评估这些变化。

接下来,我问了关于其他CA构造的Zane。他澄清了Cas9目前是CRISPR实验中最广泛的核酸酶,更具体地说是从细菌中分离的Cas9变异链球菌Pyogenes(SPCAS9)。虽然CAS9是最广泛用于基因组编辑,但它确实有一定的限制;它不是100%效率,可以具有偏离目标效果,并且它相对较大,有时难以使用公共载体递送到细胞中。

我问是否有办法。他说,为了克服CAS9的局限性,研究人员采取了几种方法,包括识别CAS 12或14等其他自然的CAS酶,还在Cas9上进行遗传工程,以产生更好的更安全的核酸酶变体对于基因组编辑。丰林澄清说,比较Zane是指较大的基因编辑工具。网站定向单核苷酸诱变仍然具有良好的效用,并且对CRISPR / CAS9非常小的编辑比较,但从更大的编辑的时间,资源和成本透视是相当不切实际的。它不能完成CRISPR / CAS9可以实现的所有不同的东西,特别是与其易用性和成本相比。

我指出,有一些非常好的网站,详细介绍了在分子水平和其他网站上的Crispr / Ca9功能如何提供科学和法律历史的概述。这些链接可以在本文的末尾找到。

然后,我们鉴于这种复杂的背景,无锡生物制剂的方法讨论了使用CRISPR技术的方法。历史上描述了丰林;他们为开发生物治疗的公司提供了发现和CDMO服务。他们专注于为细胞系工程和生物制造提供技术平台。因此,他们有兴趣在那些竞技场中应用Crispr。

我询问了CRISPR / CAS9在生物学发展中的一些应用。她解释说,从他们的角度来看,这也是他们客户的利益,他们希望优化或解决周围三个主要区域的情况。首先改善细胞生长特征,这可能会影响生物的最终制造;第二是提高细胞生产力和产品滴度,这些产品滴度也具有关于商品制造成本的重大影响;第三,看着优化或提高产品质量的方法。

我随后询​​问她是否可以详细介绍CRISPR / CAS9如何用于帮助提高产品质量。她用抗体作为一个例子解释。抗体是非常复杂的分子,有时某些单克隆和双特异性抗体可以表现出高聚集体。他们也可以在解决方案中进行分解体内因此引起不利的免疫应答或效力下降。此外,将存在糖基化曲线,其导致不良免疫应答事件或使生物治疗易于容易地清除。所有这些方案都是不希望的,CRISPR / CAS9可以帮助解决这些类型的问题。

然后,我要求Zane如何在蜂窝水平上使用CRISPR以改善生物学制造。他说,通过敲除基因或敲击或诱导基因表达,可以使用多种方法来攻击细胞培养问题和遗传工程宿主细胞。编辑基因组以改善已经良好的细胞系系统是有利的并且具有成本效益,因为这些线材很好,大多数往往具有可接受的和经过验证的安全性曲线,并且已经达到了许多次作为有效的生产者。随着基因编辑的CRISPR / CAS9的出现,它比以往任何时候都变得更容易和更快,以操纵生产宿主细胞的基因组,以改善其生物制药生产。

丰林补充说,细胞培养的最终目标是改善或修改宿主细胞鲁棒性,增长率,稳定性和寿命。当然,培养基和其他物理培养参数的变化也可以对这些产生积极影响,但每个生产宿主细胞系有局限性,只能通过细胞工程克服,这是CRISPR可以发挥重要作用。

我问她一些具体的例子,她分享了几个。提供的一个例子是对调节细胞凋亡的参数进行优化,以防止过早细胞死亡。另一个例子侧重于代谢工程基因来控制细胞周期以实现更快的细胞生长或生产率。她继续提供来自最近的研究公开的一个例子,其中通过研究人员利用CRISPR / CAS9来淘汰CHO细胞中的特异性氨基酸分解代谢基因,以减少抑制乳酸和铵等代谢副产物的生长的分泌。2

使用CRISPR / CAS9诱导蛋白质表达和增加产品滴度的另一个研究出版例是当使用来自噬菌体P1和FLP / FRT系统的CRE-LOX系统的元素的研究人员用于真核细胞以建立特异性靶基因插入进入高表达染色体基因座。3.

另外,如前所述,使用CRISPR / CAS9获得重组蛋白的理想糖基化模式4.是一种常见的功能和无锡生物学,我们具有使用CRISPR / CAS9的重要体验工程细胞系,以改变蛋白质糖基化曲线。

Zane补充说,一些研究人员正在评估CRISPR / CAS9如何影响伴侣的使用5.和折叠优化蛋白质组件和折叠,从而可以有助于改善细胞生产率和产品滴度。他强调,对于所有这些例子,如果这些基因可以产生影响,重要的是要重视。

接下来,我询问Crispr在临床试验中使用。Zane解释说,它目前用于类似于Car-T或其他细胞或病毒基因治疗方法的临床试验。尽管存在一些早期成功,但使用CRISPR存在许多挑战体内因为CRISPR / CAS9被认为是“外国”,因此免疫原性和快速间隙是巨大的担忧。另一个关注的领域是在它有机会采取行动之前的细胞中的复合物的降解。正在评估的一种迷人的方法是将CRAP / CAS复合物束缚到单克隆抗体,用于定向递送至特定细胞类型,例如肿瘤或其他特定组织。6.

丰林补充说,Zane所说的是有趣的,因为创造基于CRISPR / CAS的治疗方法是一种来自供应链的角度来看的CMC和GMP制造挑战。存在CAS蛋白和引导RNA的生产,必须进行GMP,但在示例性ZANE中,您还需要制造MAB和接头,然后进行所有各种组分的共轭。因此,所有这些元素都加入了一个非常具有挑战性的CMC程序和供应链。

大多数公司都没有专业知识来开展所有这些活动。因此,您将不得不外包许多这些活动并找到必要的专业知识。此外,尝试在所有不同的供应商和CDMOS之间协调这一巨大挑战。这就是为什么无锡生物制剂已经将所有这些能力组装在其组织中。无锡生物制剂以及无锡APPTEC公司无锡STA,可以生产MAB,CAS蛋白,化学键合物和引导RNA,并使用彼此只有几个小时的设施进行共轭。使用他们熟悉的项目管理计划,他们可以成为任何公司希望开发这些新颖的基于Crispr的治疗方法的单一来源。

我通过询问公司希望使用或改善他们的细胞系和生物制剂可以与无锡生物制剂一起使用,以确定CRISPR / CAS9是否是可行的解决方案。Zane表示,在无锡生物学,他们最近从广泛的Crispr-Cas9研究许可。现在,他们可以为有兴趣使用它用于细胞系工程的客户提供服务。

冯林通过称感兴趣的公司应联系无锡生物制剂并描述最终目标。然后,冯林与无锡生物制剂的经验丰富的细胞系工程科学家和细胞生物学家将与您合作起作用,以帮助确定是否需要使用CRISPR / CAS9。如果是这样,他们将为您进行工作,并在一起审查后续步骤的结果和确定。

附加信息:

杂志/出版物参考:

  1. 基因表达的序列特异性控制的CRISPR干扰(CRISPRI) - PUBMED(NIH.GOV)
  2. Cho Cho细胞中的复制AA分解代谢用于Crispr / Cas9基因组编辑改善了细胞生长并减少了副产品分泌 - SciEncirect
  3. 一个CRISPR-CAS9,CRE-LOX和FLP-FRT级联战略,用于将外源DNA精确高效地集成到细胞基因组中|CRISPR期刊(Liebertpub.com)
  4. 枯草芽孢杆菌 - Pubmed(NIH.Gov)中微调基因表达的Crispr辅助多维调节-
  5. ChO细胞中CRAPR / CAS9基因编辑方法调节抗体岩素化的应用 - Pubmed(NIH.gov)用Crispra-pubmed(nih.gov)的Cho细胞中唤醒休眠糖基转移酶
  6. 基因组治疗剂体内交付的承诺和挑战(NIH.GOV)

CRISPR / CAS基因编辑的技术/资源信息

CRISPR / CAS诺贝尔奖公告

新闻稿:诺贝尔化学奖2020 - Nobelprize.org

CRISPR / CAS法律/专利信息

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