询问专家 - AAV基因治疗的转染最佳实践

大多数用于基因治疗的载体目前是通过瞬态生产系统产生的,主要是由于方便和速度的过程。通过转染制造病毒载体是灵活和高效的,不需要费时发展稳定的细胞系。然而,基于转染的方法确实需要优化,以确保最高的生产力,批次之间的一致性和可伸缩性。

AAV生产中改善转染的关键领域包括:

  • 识别和解决可扩展转染的常见瓶颈。
  • 简化缩放和转染过程。
  • 设计和标准化过程的一致性,可重复的结果。
  • 以小规模转移到更大刻度的生产容器中的优化过程。
  • 维持积极的分割细胞和细胞培养健康,以获得有效的转染。

由于优化转染对于成功生产AAV至关重要,我们认为提供机会询问这些领域的最佳实践是很重要的。我们邀请了Ann Rossi Bilodeau博士,高级生物过程应用科学家,康宁生命科学和Cassie-Marie Peigné博士,科学支持专家,polyplus转染为读者提供关于转染在基因治疗应用中的AAV生产的问题的答案。

迎接专家

安罗西博士博士毕业于罗切斯特大学医学和牙科学院,获得药理学博士学位,并在芝加哥大学接受博士后培训。Ann的职业生涯始于康宁生命科学公司的应用实验室经理,在那里她利用她强大的学术和行业研究经验指导应用实验室的活动。目前,Rossi Bilodeau博士是高级生物过程应用科学家,作为技术领导生成应用程序,支持康宁生命科学的生物过程和细胞/基因治疗组合,包括康宁CellCube®和康宁HYPERStack®平台。

c m peigne.Cassie-MariePeigné是一家科学支持专家,Polyplus-Transfection®SA,领先的生物技术公司,支持基因和细胞疗法,生物学制造和生命科学研究,具有创新的核酸转染解决方案。卡西在南特大学的免疫学中完成了她的博士学位,然后是在加入Polyplus之前,在冲绳科技学院的传染病中进行了博士后地位。

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问题1

转染后HEK细胞中AAV的表达需要多长时间?

在使用Polyplus转染试剂的后续转染后24小时,在HEK-293细胞中可以在HEK-293细胞中观察到AAV的瞬时表达。病毒矢量生产.在转染后标准收获时间通常为48-72小时,无论您是使用粘附还是悬浮液适应的HEK-293细胞。根据血清型,并且在AAV载体携带的感兴趣的基因上,它可以在稍后的时间点中收获,转染后长达10天。我们建议在不同的时间点收获以评估该过程的最佳生产率与成本效益。

问题2

减少质粒和/或保持转染成本的使用的最佳方法是什么?

实际上,质粒DNA通常是提高转染步骤的成本。较少的长凳刻度,但它在更大的比例中迅速变得昂贵,甚至更有速度,所以当您需要开始使用GMP级原材料生产。为了降低所用质粒的量,策略主要依赖于转染试剂,其可以允许在质粒DNA中显着降低。通常具有多普次转染试剂,与使用替代方法相比,可以将DNA的量减少至少20%。在第二步中,转染参数的优化,转染和转染时的VCD和梳理时间可以进一步提高生产率,因此有助于进一步降低每个AAV生产批次的总成本。要进一步迈出一步,如果您在建立生产系统方面具有灵活性,生产介质是值得评估的参数,以开发一个可扩展以满足您的AAV制造需求的过程。

问题3

我正在寻找最简单的方法来确定我的系统的正确AAV Serotype。我使用文学搜索缩小了它,但有一种简单的方法来测试几种血清型。

深入研究文献是缩小不同系统潜在AAV血清型名单的最好方法之一。首先在小范围内用某种类型的报告型结构来测试少数最优的候选基因,以检测转导的效率。商业上可获得的检测试剂盒包含用于GFP表达的预先制作的多种血清型病毒库存(例如,Vector Biolabs的AAV血清型检测试剂盒,GeneCopoeia的AAVPrime™腺相关病毒(AAV)血清型检测试剂盒)。最后,从这些测试中选择一到两个最好的,然后进行你感兴趣的基因小规模测试。

问题4

您是否建议使用前进行测序质粒?

是的,我们建议使用前排序质粒。确认质粒的序列和鉴定最终可以节省时间和资源,这些资源进行故障排除可能不会产生传染性病毒颗粒的转染过程。188jinbaobo

问题5

故障排除问题 - AAV的包装限制是什么以及如果您接近限制会发生什么?

AAV向量的大小限制约为5 kB。一些血清型可能接受更大的基因,但大多数文学都在包装中的成功约为4.4至4.7 kB。几个出版物研究了超过AAV有效载荷的影响(例如,J Virol 2005的Grieger和Samulski,Doi:10.1128 / JVI.79.15.9933-9944.2005Wu等人。2010年Mol Ther 2010,DOI:10.1038 / MT.2009.255).

一般来说,接近限度会影响包装效率:尺寸越接近限度,效价越低。然而,有许多发表的报告描述了包装更大的转基因的替代策略,如分裂的AAV载体和片段组装。

问题6

根据您的经验,您是否发现基于融合的AAV产量有显著差异?对于转染前的融合,您有什么建议?

有几个原因,细胞汇合是一个关键参数。它对转染效率直接影响,以及对过程的再现性和稳健性。重要的是指转染试剂方案,因为在比较几种转染试剂时最佳汇合可能不同。

对于AAV生产在Adactent HEK-293细胞中,我们建议使用PEIpro转染试剂.当使用这种试剂时,转染时60-80%的一致性是最理想的,因为细胞仍处于指数生长阶段。为了提高该过程的稳健性,在转染时考虑VCD和每百万细胞的DNA数量,以确保最佳的融合。

问题7

我希望加快我的AAV生产,并想知道您是否有提示或者您推荐生产套件?

通常预期生产套件含有细胞,培养基和转染试剂。这些都是良好的基准级生产系统。但是,使用套件提出了两个主要问题:1)缺乏灵活性,而且2)不适合大规模制造。

无论是小还是大规模,都能够根据选择细胞,生产培养基和转染试剂所需的AAV血清型优化生产是有利的。对于可扩展的生产过程,需要具有成本效益,并且通常完整的生产工具包不适合大规模生产,因此不会带来降低成本的好处。在小规模中具有筛选步骤是非常重要的,以确定最佳的工具(细胞,培养基和转染试剂),以最大限度地产生全颗粒。188jinbaobo确保您成功设置的有效方法是从您正在使用的供应商联系科学支持团队,以确保您选择最佳工具并具有简化的流程。康宁和Polyplus都有科学支持团队可以回答问题。

康宁生命科学科学支持

Polyplus科学支持

问题8

我们看到在生物反应器转染过程中一批一批不一致的产量。你有一些故障排除的技巧吗?

可以通过优化转染步骤来解决批量变化,以便具有稳健的生产过程。对于转染步骤至关重要的参数是使用的转染试剂,并且每次右尺寸复合物都能形成转染试剂,以有效地将DNA货物递送到细胞中。因此,转染混合物的制备是实现右尺寸络合物的关键。考虑的关键参数是转染的每百万细胞DNA的量,DNA与试剂比,混合策略和长度和络合物的稳定性。使用Polyplus转染试剂,这些参数已经过优化以简化您的任务。通过联系Polyplus可以进一步精炼或适应您的设置科技支持团队。最后,重要的是要确保转染的VCD与一个批次保持相同。

问题9

我们正在寻找一个良好的规模,为我们的rav生产模型,但在寻找专为AAV生产而设计的模型。

良好的缩小模型应该以最终的生产规模模拟AAV生产过程,最终比例是中间的还是大,粘附或悬浮液。虽然可能无法小型上游生产的各个方面,但对于实现可比细胞扩展参数并利用可扩展的转染过程尤为重要。因此,选择用于细胞秤/输出的合适血管和适当的转染试剂是缓解从过程开发到制造的转变的关键。作为依赖文化的一个例子:康宁HYPERFlask®或康宁HYPERStack®12层容器可以作为Preverstack-36船舶最终扩大的生产的过程开发船只;康宁CellSTACK®1层容器或Cellstack 2培养室在Cellstack-10或Cellstack-40腔室中模拟较大的刻度培养物;康宁蜂窝手机®10层或Cellcube-25层模块直接划衡到CellCube-100层模块。

对于悬浮培养物,许多生物反应器模型可用于小型通过大规模细胞培养的广泛体积。一旦建立了细胞培养平台,就会使用专门针对直接可扩展性优化的试剂进行转染过程。

Polyplus转染'PeiproFectorvir.设计用于粘附和悬浮池中的稳健和可重复的转染,以通过大规模的临床级制造实现从小规模过程开发的高滴度AAV产量。

问题10.

两个问题,你认为aav生产的典型滴度是什么,你能做些什么来增加它?

通常,AAV生产滴度约为10E11至10E12,在Vg / ml和10E8至10E9 TU / mL中。要将这些数字置于透视图,重要的是要记住,即使在使用相同的生产过程时,两个AAV血清型很可能不会给出相同的产量。AAV生产产量因血清型和感兴趣的基因而异。增加给定AAV的产量的最佳方法是过分临界参数,直接对产量产生影响:质粒DNA,转染试剂,细胞和培养基。

  • 质粒DNA- 使用DOE方法,可以精制转基因/包装/辅助质粒比,以及每百万细胞的最终DNA量以提高产率。
  • 转染试剂-比较转染试剂达到最高产量,进一步细化质粒DNA/转染试剂比,提高转染效率和基因表达。
  • 细胞和媒体- 为您的瞄准,依赖或悬浮液的规模,最佳细胞培养系统。

问题11.

我们对我们的质粒污染有问题。您为内毒素推荐什么样的筛选或删除?

低内毒素质粒制剂有两种基本选择:进行自己的制剂和内毒素测试或合同到外部公司的筹备工作。该选项最佳的决定归功于权衡资源与效率,高度依赖于您的实验室资源,时间表,规模和最终应用。对于内部准备,利用市售的质粒预备试剂盒,其指定低内毒素或无内毒素的质粒制剂。然后可以用市售的LAL(钙氨基细胞裂解物)测定试剂盒测试质粒制剂。或者,用质粒生产服务发送您的质粒至一家公司,例如Aldevron为研究级、GMP源和GMP质粒提供质粒制造。

问题12.

正如我正在扩大我们的追求过程,我并没有以小规模的比例相同的比例。我该怎么办才能改善这个?

首先是在优化转染过程时,在活细胞密度而不是绝对表面积的方面思考。换句话说,计算每百万细胞的DNA和转染试剂的量。务必表征培养物如何在缩放血管中生长(例如,细胞产量,倍增时间),在那里您正在进行转染以准确评估转染的细胞密度。如果可能的话,将具有相同生长动力学的对照容器进行在转染日时收获以确定细胞密度。以这种方式对细胞生长的正常化可以考虑不同尺寸和/或细胞培养容器之间的不一致细胞生长,并确保在缩放时可重复转染。同样重要的是,转染试剂设计用于可伸缩转染,例如来自多人转染的可缩放转染,使得通过中间生产从小规模开发的鲁棒转染复杂地层能够通过中间生产。

问题13.

质粒的获取有一个问题,这在我们的过程中造成了一个真正的瓶颈。你有什么建议吗?

缓解这一瓶颈的最佳方法是与有能力生产大规模GMP源或GMP质粒的供应商合作。

问题14.

我们正在衡量外包与生产我们的rav。你能谈谈每个人的想法吗?

在权衡是否外包或生产rav内部时,有几个因素 - 几乎太多,在这个论坛中详细展开。重要的是,必须考虑从质粒生成对上游细胞培养和通过下游净化和分析进行转染的所有步骤必须进行决定。Some of the major factors to consider include: project timelines, the volume/titer needed versus your capacity to produce (i.e., what scale can your facility handle?), short- or long-term needs, research-grade versus GMP, cost in both materials and labor, application for the viral particles, and available expertise to design and troubleshoot the production and analytics. In the end, it comes down to a question of whether it is better to relinquish control of the process for the sake of efficiency or it is necessary and worth the investment of time, money, and resources for your specific application to produce in-house. For one perspective, the following article discusses the rationale of one company behind establishing in-house manufacturing:标记名为“在AAV制造中取得成功”。Biopharm International 2021; 34(3):34-37。

问题15.

PEI与AAV转染的其他方法之间最大的差异是什么?有不同的媒体要求吗?

有几种转染方法产生AAV。您可能已经遇到了更常见的基于聚合物的转染试剂,例如PEI,脂质和磷酸钙。与脂质和基于钙的基于聚合物基转染试剂更适合生产aavs的pei和基于聚合物的转染试剂是生产率和成本效益。有几种可商购的PEI,但只有一只PEI针对病毒载体生产优化:peipro®..与磷酸钙相比,PEI基转染可以减少10倍的DNA量,并且可用于转染在存在或不存在血清的存在下生长的细胞。它通过与大多数生产平台,粘附或悬架兼容的Go-transfection试剂来带来多功能性和可扩展性,因为大规模生产容量。与基于脂质的转染试剂相比,PEI基转染专为大规模生产而设计:通过大大降低每种生产批次的成本并与大多数生产介质和络合介质兼容以适应每个制造商的过程是成本效益的。最后但并非最不重要的是,需要在更高质量的成绩下进行转染试剂,理想的是GMP Pharma等级,以继续产生临床批次,并且必须尽早考虑试剂以保证效率从PD转变为制造。

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