将3D模型带入高吞吐量环境中

伊丽莎白亚伯拉罕博士- 高级产品经理,康宁生命科学
2008年以来,伊丽莎白已在康宁生命科学(CLS)中受雇,并在各种职能中担任多个职能,包括研发,项目管理和业务。在CLS,她领导了各种新产品的发展,包括高级细胞外基质/表面涂层和实验室装置,用于哺乳动物初级和干细胞的培养。她曾撰写了23篇期刊文章,技术说明,是11项专利的发明者188jinbaobo。在她早期的职业生涯中,她在细胞疗法中进行了评估潜在的干细胞治疗糖尿病。目前,她是有机体和3D细胞培养产品的商业领先;将客户的声音翻译成新概念并在全球范围内将其商业化。

希拉里谢尔曼- 高级科学家,康宁生命科学
康宁生命科学家的高级科学家应用实验室位于肯尼布金,我。希拉里自2005年以来一直在康宁,并致力于各种细胞类型,包括哺乳动物,昆虫,初级,干细胞和在大量应用中的有机体。她的主要角色在康宁中涉及创建技术文件,如协议和白皮书,以及为康宁销售部队和客户提供技术支持和培训。希拉里收到了她的B.S.新罕布什尔大学生物学学位。在过去的几年中,希拉里专注于3D细胞培养应用,包括人体有机体培养


3D细胞文化模型为许多关键研究领域提供了一个先进的工具,包括:了解生物机制,建模疾病状态,治疗药物筛查,癌症研究和毒理学筛查。此列表并非详尽无遗,只能代表当前正在使用3D模型的少数区域。

3D细胞培养经常在细胞外基质的存在下生长。例如,康宁的基质素基质是一种自然细胞外基质(ECM)的水凝胶,在3D细胞培养中广泛使用和参考,以支持有机体和球状形成。随着吞吐量需要增加3D细胞培养建模的领域,需要支持增加吞吐量的新工具。这包括需要更方便,一致的预涂层基质矩阵选项。

为了提高用3D模型进行筛选的产量,康宁开发了预涂覆的96-和384孔微孔板,具体用于3D细胞培养物。这些板易于使用,并以高通量格式提供预先分配的基质素基质的便利性,同时提供这种测定所需的一致性。这些产品使“顶部/三明治”和“嵌入式”工作流能够生成3D细胞培养物。

由于增加任何细胞培养技术的吞吐量充满了独特的挑战,我们已经组建了一支专家组,以回答您关于如何提高3D细胞文化模型吞吐量的问题。

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问题1

使用扁平的ULA,圆底,微腔和Matrigel选项3D如何为我的应用程序选择正确的模型。

合适的产品真的取决于您尝试创建的模型。如果您尝试创建不需要像球状等极性的3D结构,则ULA产品很棒。Flat Ula产品将营造大量的球形,但它们将具有不同的形状和尺寸。如果需要均匀的球体圆底ula板,如球体微孔板是一个很好的选择。Microcavity Ula板通过每孔形成多种均匀的球体,提供了最佳的平板和圆形ula产品。如果模型的极性是必需的,则有器有器件而不是Matrigel,或者可能需要一些其他ECM。

问题2

我应该使用什么浓度Matrigel进行3D筛选?

我们建议使用至少150-200UG / CM2 MATIGEL进行3D应用。可能需要针对您的特定应用进行优化。或者,您可以尝试针对3D培养优化的Matrigel矩阵-3D板,并且已经涂覆有未聚合的基质胶。

问题3.

我看到一些方案在播种之前将细胞与matrigel混合,并且在Matrigel上添加细胞的其他细胞。哪个是最好的?

它真的取决于应用程序。如果目标是为蛋白质分析提取大量的3D结构,或者均匀的终点测定嵌入式方案可能是良好的选择,因为它们是快速和简单的。如果需要成像嵌入协议并不理想,因为在整个中,3D对象混合,这可能导致长扫描时间必须专注于这么多不同的平面。夹心方案涉及在添加细胞之前将聚合基质胶床铺设。这允许细胞在更窄的焦平面中沉降,以便更容易和更快的成像。

问题4.

我看到3D细胞文化的价值及其在高吞吐量筛选中的应用程序,但是我的困难是可以跟上需求的成像系统,以及如何快速组织和评估所产生的所有数据。

你提出的积分肯定会有所限制。需要考虑的一个解决方案是限制分析的数据量。对于某些应用,分析3D对象的最大投影可能足以回答被问到的问题。最大投影是堆叠成一个图像的对象的所有共聚焦图像的表示。与查看所有单独的Z堆叠相比,这需要更少的时间来分析。不幸的是,这项技术并不是那么好,但它越来越好了。3D图像质量正在改进和更快,具有允许在较低倍数下进行预扫描的功能,以便在移动到更耗时的更高放大率成像之前首先识别感兴趣的对象。将高分辨率图像限制为“根据需要”的基础是另一种可以减少数据收集的方式。

问题5.

我们正在使用一种脚手架的方法来培养我们的心脏球体,并且存在均匀尺寸的问题,这导致信息不一致,营养素分布不均匀。你有什么建议吗?

脚手架的产品如康宁®球形微孔板康宁ellasia®板具有专门的几何形状,设计用于产生均匀的球形。独特的井几何形状力能够均匀地沉淀到空腔中以形成一致的球状体。平底支架的无支撑产品不具有专门的井几何形状,这通常会导致许多非均匀的3D结构。

问题6.

您是否建议仍然嵌入Matrigel基质的同时进行成像球状体,或者我们应该在成像之前溶解Matrigel基质?

在仍然嵌入的同时可以成像球形和有机体Matrigel基质取决于放大率和正在成像的内容。实际上这可能是活/死染色和有机纤维肿胀测定所必需的。我们发现夹层/覆盖工作流程方法,其中细胞在基质素矩阵的厚层顶部上播种,因为球状体主要在单个焦平面上的成像更容易并且更快地成像。或者,小Matrigel基质液滴也足够薄,以便在低放大率下快速成像。对于在更高的放大率下或嵌入厚凝胶中的有机体时的较大有机体的标记染色它可能有助于在染色之前去除结构。我们建议您需要从Matrigel矩阵中删除小区。康宁细胞回收溶液用于在Matrigel基质中培养的细胞/球状体。该溶液将允许非酶促检索球体和有机体。它可以在4℃下将厚基质胶质基质层除去并促进细胞检索。这里有一个协议。还应注意,某些固定剂如多甲甲醛可以解析基质基质。如果需要Matrigel基质,保持完整性,加入最多1%的戊二醛以固定剂可以有所帮助。

问题7.

我们发现在Matrigel矩阵中对我们的细胞进行了成像时发现了背景噪声,您是否有推荐用于删除此项?

用所有类型的基质素基质进行了免疫染色。但是,使用酚红免费Matrigel基质将减少自发荧光/背景噪声。

问题8.

新的Matrigel Matrix-3D板是否会使自动化更容易实现?我们过去的困难与Matrigel矩阵温度要求用于我们的液体处理系统。

是的,新的Corning®Matrigel®Matrix-3D板是自动化兼容的,提供高通量测定所需的便利性和一致性。板块消除了处理ECM分配的需要。这是搁板预包装选项减少了手动操作期间可能发生的不准确性。Corning®Matrigel®Matrix-3D板有384孔和96孔格式。要了解有关使用Corning®Matrigel®Matrix-3D板的更多信息,请阅读使用指南。你也可能会找到这个应用笔记这种覆盖在整个测定中使用新的板材有用。

问题9.

媒体在整个板上变化 - 可能?如果是这样,那是最好的方法吗?

只要抽吸不太靠近Matrigel层,就是可能的。例如,我将50μl细胞悬浮液加到96孔板上,并尝试在添加另一种新鲜50ul之前删除40UL左右。或者,我也有成功的成功只需添加更多的新鲜培养基或化合物而不吸入任何培养基。

问题10.

如果我的申请需要更稀释的matrigel,我可以容易地稀释预涂层的板以获得所需的最终浓度吗?

虽然格式可能允许您这样做,但注意是它会影响形成3D结构的能力;我们建议遵循我们的用户指南以获得最佳成功。

问题11.

收获这些小井格式板中产生的有机体或球形的最佳方法是什么?

为了回收活器或球状体,我们建议使用康宁细胞回收溶液来解聚的基质胶。这是一项通用协议https://www.corning.com/目录/ CLS /文件/协议/ CLS-AN-528.PDF

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