细胞疗法需要明确定义的优化媒体,以实现研究,临床和制造规模培养之间的有效转变

细胞疗法在临床环境中的持续成功使人们更加注重优化这些疗法的制造工艺。特别是,用于临床的细胞扩增是至关重要的,并且需要一种适合临床和商业生产的高度优化的培养基。该行业越来越倾向于使用定义明确的培养基,而不添加血清。此外,临床和最终的商业制造需要一个可扩展的过程。这包括一种能够实现大规模制造系统的介质,如基于微载体的悬浮培养平台。为了满足这些需求,MilliporeSigma发表了一篇文章,描述了他们使用Stemline®XF MSC培养基和3L Mobius®搅拌槽生物反应器来提高产量和功能。Stemline®XF MSC培养基用于平面和微载体培养平台的有效扩展,简化了研究、临床和制造规模培养之间的过渡。

我们很幸运能够在下面的完整文章中,并与Kathleen Ongena采访,博士,客户申请,细胞疗法生物切割负责人。


Stemline®XF MSC培养基在3l Mobius中具有高产量和功能®搅拌釜反应器

摘要

优化体外为临床使用准备的细胞扩张过程是细胞治疗制造的关键步骤。考虑到治疗和挽救生命的影响,这些疗法可以对患者,表现和质量是任何扩展过程的基本产出。在这里,我们讨论了Stemline®XF MSC培养基的性能,它可以促进人间充质基质/干细胞(hMSCs)向高密度扩展,同时保持细胞的特性和质量。该产品旨在有效扩展平面和微载体文化平台,简化研究、临床和制造规模文化之间的过渡。我们描述了体外在3 L搅拌槽生物反应器-微载体平台中,Stemline®XF MSC培养基培养骨髓来源的hMSCs。

介绍

干细胞治疗的长期前景预测,将转向更明确的媒介和高质量的原材料。目前,大多数用于临床的MSC产品仍使用胎牛血清(FBS)。由于许多原因,细胞治疗开发人员正被鼓励在产品开发的早期阶段远离血清的使用1.替代配方包括通常归类为“无血清”、“无xeno”或“定义”的溶液。

开发一个定义明确的、可扩展的生物过程对于产生强健和安全的细胞疗法也很重要2.为了支持这种视觉,需要增加与基于微载体的悬浮培养平台相容的细胞疗法试剂的需求。这将允许小型研究和大规模治疗制造,而无需在进入治疗开发过程的新阶段时需要重新定义临界试剂。

临床前和临床水平的数据对于确定hMSC治疗不同疾病指征的安全性和治疗效果至关重要3..因此,研究支持高性能扩展和与可扩展制造流程兼容的血清替代介质配方是非常有益的。在此,我们详细介绍了在3 L搅拌槽生物反应器-微载体平台中,Stemline®XF MSC培养基中培养骨髓来源的hMSCs的过程参数和生长结果。

方法

STEMLINE®XFMSC培养基,由StemLine®XFMSC基础媒体(Cat。No.14371C)和STEMLine®XFMSC补充(Cat。No.14372C)组成,用于我们的3LMobius®BioreActor系统,具有最小的过程修改。

骨髓衍生的HMSCs在STEMLINE®XFMSC培养基中进行缩放,α-MEM补充有5%的人血小板裂解物(HPL)或市售的无异酚竞争培养基。每种培养基以终浓度为2mm的L-谷氨酰胺补充。向每个培养基中加入剪切保护剂。选择胶原型I型涂层微载体用于HMSC膨胀。

在试验过程中,连续监测溶解氧(DO)和pH值,分别控制在50%和7.4。每天测量营养和代谢物水平(BioProfile®FLEX2, Nova Biomedical)。l -谷氨酰胺和葡萄糖浓度下降到初始水平的50%以下后恢复。采用人工采样法测定细胞总数,重复计数3次。

在生物反应器培养的第8天收集hMSCs。流式细胞术检测细胞表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105、CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a、CD106、CD274和HLA-DR的表达。在Stemline®XF MSC培养基中扩增的细胞的效价也被测定。在生物反应器膨胀后,将hMSCs重新镀在组织培养瓶中,并通过添加25 ng/mL(最终)肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ的培养基激活(授权)。3天后,采用流式细胞术检测免疫功能相关表面标志物CD274、CD54、HLA-DR、CD80、CD40、CD86的表达。通过测定细胞培养上清中l -色氨酸和L-kynurenine的浓度,测定活化的hMSCs的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)活性。采用AdipoMAX分化培养基(Cat。不。SCM122-1KT)、ChondroMAX分化培养基(Cat。不。 SCM123) and OsteoMAX-XF Differentiation Medium (Cat. No. SCM121).

结果

结果

总体而言,在StemLine®XFMSC培养基中扩展的HMSCs显示出优异的生长性能(图1)。在八日培养后,利用STEMLLINE®XFMSC培养基获得8.3 e + 08总可活细胞的产率,其次与AMEM + HPL的5.25℃+ 08个细胞,3 e + 08与卵巢竞争对手中等的。累积群体双人掺杂为5.6,STEMLINE®XFMSC培养基,5.0,AMEM + HPL,4.2,与竞争对手无卵巢培养基。

Mobius®3L生物反应器中微载体生长的比较。
图1所示。Mobius®3L生物反应器中微载体生长的比较。第8天的总细胞计数表明StemLine®XFMSC培养基优于AMEM + HPL 58.3%,可商购的异种制剂178.9%。

在添加培养基和微载体期间,pH值和溶解氧在控制范围内,在第3天出现显著峰值(数据未显示)。与其他培养基相比,Stemline®XF MSC培养基的养分消耗和废物产生增加,并与较高的生长速率相一致(图2)。

3 L生物反应器膨胀过程中营养物质和代谢物分布的比较
图2(A-D)。3 L生物反应器膨胀过程中营养物质和代谢物分布的比较。使用Stemline®XF MSC培养基,hMSCs消耗更多的葡萄糖(A)并产生更多的乳酸(B)。同样,使用Stemline®增加了谷氨酰胺消耗(C)和铵产量(D)。

我们发现,在Stemline®XF MSC培养基中扩增的hMSCs在3l生物反应器培养后保留了典型的鉴定标记和效力。细胞高表达CD44、CD73 CD90、CD105,伴随CD11b没有表情,CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a、CD106, CD274和HLA-DR(图3)。hMSCs成功分化成脂肪细胞,内层,如图所示,成骨细胞的脂质空泡油红O的积极污渍,与Alcian Blue的糖缀合物,与茜素红的钙沉积(图4)。TNF-α和IFN-γ孵孵期3天后,与免疫功能相关的若干MSC表面标记物,包括CD274、CD54和HLA-DR,均被上调(图5)。4..经许可的hMSCs增加了IDO活性,这可以通过显著消耗l -色氨酸和生产L-kynurenine来证实(图6)。

3 L生物反应器扩增后表面标志物表达的比较。
图3。3 L生物反应器扩增后表面标志物表达的比较。三种培养基均观察到典型的骨髓源性hMSC表面标记物表型。CD90、CD105、CD73、CD44表达阳性,CD106、CD274、CD19、CD34、CD11B、CD79a、CD14、CD45、HLA-DR表达阴性。
使用Stemline®XF MSC培养基进行3 L生物反应器扩增后的hMSCs三世代分化。
图4。使用Stemline®XF MSC培养基进行3 L生物反应器扩增后的hMSCs三世代分化。经过各自的分化过程后,这些细胞保持了分化成组织染色阳性的脂肪细胞(A)、成软骨细胞(B)和成骨细胞(C)的能力。
用Stemline®XFMSC培养基培养的持牌HMSCs免疫调节表面抗原的上调
图5。使用Stemline®XF MSC培养基培养的hMSCs免疫调节表面抗原上调。这些细胞保留了调节免疫相关功能的特性

在3L生物反应器中膨胀后表面抗原水平。CD274,CD54,HLA-DR和CD40的表达增加。将标记CD90作为对照。

用STEMLINE®XFMSC培养培养的人体MSCs通过IDO活性在3L生物反应器中膨胀后通过IDO活性保留免疫调节能力
图6。用Stemline®XF MSC培养基培养的人间充质干细胞在3l生物反应器中扩增后,通过IDO活性保持免疫调节能力。l -色氨酸在培养基中以增强的速率被耗尽(A), L-kynurenine被生产(B)与许可的细胞。

讨论/摘要

StemLine®XFMSC中等常量优于具有3L生物反应器培养的替代异种配方。该介质中HMSC增长率的增加对制造策略具有明显的影响,可能允许新产品具有更短的扩展时间表,并增加试剂,材料和劳动力的节省。在该培养基中扩增的细胞也保留了3L生物反应器培养后的原型MSC同一性标记和免疫调节能力。

我们的数据证明了Stemline®XF MSC培养基在基于微载体培养的基质细胞生物反应器中扩展的实用性。与其他无xeno的替代物相比,高产量的功能性hMSCs产生。高质量的培养基和补充剂定位于动态影响细胞制造过程,并将加强蓬勃发展的细胞治疗领域的发展。

采访Kathleen Ongena博士,细胞治疗生物加工客户应用主管

除了胶原蛋白类型之外,是否考虑过本研究的其他微载体?

本研究用胶原蛋白进行,因为它是历史上用作控制的。在更新的研究中,我们正在评估不同的无异种微载体。

在Stemline XF MSC培养基中,细胞从微载体中释放出来进行下游分化时,与传统配方相比是否存在差异?

Healline XF MSC培养基的收获产率比AMEM + HPL高30%,比商业上可获得的异叶培养基的产率高45%。这些数字趋势与整体增长型材。有趣的是,MSC最容易与来自茎线培养物所取的微载体解离。有许多微载体 - 细胞聚集体,特别是来自未解离的AMEM + HPL培养物。与茎线培养相比,这导致收获效率降低。

是否建议对HMSC文化感兴趣的研究人员从这种制定开始,以便在从2D平面培养物中移动到生物反应器文化时,他们不需要从基于FBS的媒体转换?

是的,建议首先启动SementLine XF MSC介质配方中的种子列车,如本技术说明所述。理想情况下,MSCS在符号XF MSC介质中从其组织源衍生或分离。

在Stemline XF培养基中能分离到hMSCs吗?

我们使用不同类型的无异形涂料和表面,从培养基中孤立的MSC。我们计划进一步调查不同的条件并分享我们的研究结果

您是否可以通过在传统的2D平面技术上对HMSC文化进行HEMMSC文化的表现?

我们已经看到了2D平面培养的Stemline XF MSC媒体的强劲表现。尽管并不总是需要,但一些细胞系将受益于专用的亲水性表面或无异叶涂层。

由于细胞的倍增率明显更快,与需要更长的培养时间来获得相同数量的细胞的培养基配方相比,细胞在培养中花费的时间更少。您能说说这对下游应用程序的好处吗?

较短培养时间的主要好处是更容易获得产品。收获、浓缩和最后填充的下游过程不应受培养时间的影响,特别是如果细胞特性保持不变。在治疗方面,一些研究显示MSC的效力随着时间的延长而降低,以及基因异常的积累体外.如果这些现象与培养持续时间相关而不是累积倍增的数量,则支持更快的增长的介质肯定是有益的。

这一策略是否应用于其他来源的间充质干细胞-如沃顿胶-脐带,诱导多能干细胞来源间充质干细胞?

本技术说明中描述的策略或过程是用骨髓衍生的MSCs开发的。使用不同类型的MSC或干细胞时,可能需要一些优化过程。

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