解构质粒预备 - 优化提示

许多分子生物学学科的最常用的实验室任务之一是从细菌中纯化质粒DNA。该方法的难以取代标准氯化铯梯度纯化的市售质粒萃取试剂盒的推广。虽然质粒提取套件可从许多不同的研究供应商获得,但是该过程在所有这些过程中大多是相同的。简而言之,细菌细胞在液体培养物中生长,由碱性缓冲液裂解,然后通过一系列柱洗脱和缓冲液纯化得到的质粒DNA。虽然这些商业型试剂盒简化了质粒萃取过程,但其原始的缓冲液和简单的说明,重要的是要注意每个步骤的目的,应该正确评估可能出现任何问题的任何问题。本文将在质粒提取过程的每一步中分解发生的情况,并且任何偏差可能影响最终产量。

在你开始之前

虽然标准提取方案适用于大多数构建体,但可能需要一些改变以获得来自具有某些特征的质粒的高产率。在尝试提取之前,确定这些特征(质粒大小,拷贝数,宿主菌株)是重要的。标准提取试剂盒能够将高达150kb的质粒纯化,但大于50kb的任何构建体应使用加热至约65kb的洗脱缓冲液。在洗脱步骤期间,这些较大的构造更可能粘在过滤器中,因此使用温热的洗脱缓冲液有助于将它们释放到最终洗脱液中。对于超过所用套件的最大尺寸限制的任何质粒,必须使用设计用于大质粒的特殊套件。质粒的拷贝数将决定其在细胞裂解物中的浓度。对于具有非常高拷贝数的质粒,应使用减少体积的液体培养物来避免超载旋转柱。同样,具有非常低拷贝数的质粒应增加液体培养物的体积以补偿低浓度。最后,所使用的宿主菌株也可以影响最终产量。理想情况下,应使用低内核酸酶活性的菌株来防止产生的DNA的降解。 Due to the myriad of strains to choose from, it is prudent to consult the kit’s guidebook to obtain recommendations for optimal host strains.

步骤一 - 液体培养的生长

该步骤的目的是将细菌细胞生长为在以下步骤期间用目的质粒转化的细菌细胞。要识别理想的主体应变,请参阅本文的上一部分或提取套件提供的手册。为了开始,应在具有与构建体赋予的抗生素抗性基因对应的抗生素的板上将转化的细胞划合。这将允许选择含有感兴趣的质粒的单一菌落。然后应挑选单一菌落并用于接种LB培养基的管。这些液体培养物应该生长到生长的对数阶段的结束,理想地是静止阶段,以避免细胞死亡和随后释放内切核酸酶。应使用OD600测量监测增长,通常需要12-16小时。在这里记住的关键因素是殖民地的选择和最终液体培养的密度。如果使用没有抗生素的板,则不能适当地选择适当转化的细胞,并将导致产量大大降低。如果液体培养物不生长为适当的细胞密度,或者如果液体培养物覆长且大规模细胞死亡,则可以说也可以说。

步骤二 - 重悬浮和裂解液体培养物

在生长细菌培养物之后,将它们在离心机中沉积并重新悬浮在试剂盒的重生缓冲液中,这使细胞与萃取缓冲液平衡。接下来,加入碱性缓冲液以粘合细胞。该缓冲液通常由诸如氢氧化钠,洗涤剂如十二烷基硫酸钠等强碱组成,以及用于分解任何游离RNA的RNase。洗涤剂完全溶解细胞膜,该细胞膜将细胞内容物暴露于碱性缓冲液中,所述碱性缓冲液使大型大分子如染色体DNA,质粒DNA和蛋白质。第二步是时间最敏感的步骤,因为裂解过程需要在套件指令中概述的时间点中和。中和发生的情况过早将导致细胞膜的不完全溶解,防止最大量的质粒被释放以供以后纯化。出现的中和太迟会导致质粒DNA被碱性缓冲液损坏。为获得最佳效果,当套件指定时,将终止裂解步骤至关重要。步骤2对处理反应的条件也非常敏感。在裂解期间,染色体DNA高易受剪切的影响,因此应尽可能轻柔地处理反应。 If reactions are mixed too vigorously, i.e. by vortexing, chromosomal fragments will be unable to be removed during the purification steps and will contaminate the final plasmid sample.

第三步 - 中和裂解反应

在裂解反应完成后,加入酸性缓冲液以中和反应。结果,染色体DNA,蛋白质和任何剩余的洗涤剂沉淀出溶液。质粒足够小以保留在溶液中,并且能够在盐 - 洗涤剂复合物中捕获所有洗涤剂的所有洗涤剂捕获。由于质粒不会与离心机柱树脂结合,如果它们仍然变性,则必须彻底混合溶液以确保洗涤剂的完全沉淀。与步骤二一样,应通过反转管来轻轻地进行混合以防止任何染色体DNA的剪切。然后可以通过离心从中和混合物中除去沉淀物。

第四步 - 纯质粒DNA洗脱

在步骤三完成之后,然后可以将清除的裂解物装载到由试剂盒提供的离心柱上。完成初始旋转以将质粒DNA粘合到塔的树脂中。裂解物的盐和pH条件确保质粒选择性地与树脂结合,而任何可溶性蛋白质或其他污染物流过。将中盐缓冲液加入到柱中,并在另一个旋转期间流过,其除去可与树脂结合的任何污染物。最后,高盐缓冲液用于从树脂中洗脱结合的质粒。如果洗脱缓冲液已用于先前的萃取,则建议洗脱缓冲液在用途之前进行高压灭菌,以除去可能污染其的任何核酸酶。

包起来

总之,用户友好的质粒提取套件大大简化了普通实验室任务。虽然Premade缓冲区使过程易于遵循,但这可能导致研究人员之间的断开和每个步骤的基本原理。每个步骤的摘要如下。第一步增长液体培养中的转化细菌细胞,并且可能从不正确的生长密度或选择不正确的宿主菌株产生误差。第二步骤是重悬的细胞的裂解,并且误差可能不会在碱性缓冲液中孵育过长或太少。第三步是碱性缓冲液中和的中和,误差可以从过于剧烈的混合中产生。最后,第四步是纯质粒DNA的洗脱,误差可以由RNase污染的洗脱缓冲液产生。

关于作者

Joseph iovine是康涅狄格大学分子和细胞生物学系的博士学生。他得到了他的B.。在2019年罗本大学的生物化学中,目前是桤木研究小组的成员。他的研究兴趣包括膜蛋白,膜 - 活性聚合物和生物学。

来源

https://www.qiagen.com/us/knowledge-and-support/knowledge-hub/technology-and-research/plasmid-resource-center/growth-of-bacterial -cultures

https://www.qiagen.com/us/knowledge-and-support/knowledge-hub/technology-and-research/plasmid-resource-center/key-steps-in-plasmid-purification-protocols.

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