通过无血清和无血液转化素的瞬态转染增强

抽象的

增强粘附细胞瞬时转染的方法鉴定了许多不同的配体,可改善质粒摄取到细胞中。在这些配体中,众所周知,血清衍生的转移素以改善粘附细胞的转染效率。然而,迄今为止,尚未测试无血清和无血的转移素以改善转染效率。因此,我们创建了一种改善转染效率和病毒滴度的方案,而不需要血液衍生的转铁蛋白。过量的转移素不会产生负面影响,并掺入无血清和无血清的重组人转移素,其在化学定义的无血液的培养基中支持高转染效率和病毒滴度。

背景

瞬时转染依赖于质粒DNA与细胞膜的自发融合和随后的内吞作用和贩运核,以实现瞬态基因表达。对聚合物或脂质进行的改进导致可商用的许多商业产品,用于高效转染。然而,这些产品仍然含有细胞的融合和细胞对内核外虫糖的能力。

提高细胞采用质粒DNA的能力的方法已经鉴定出跨膜受体可以作为细胞外DNA内化入口的港口。虽然细胞上有数千个可以存在的受体,但随着每种细胞需要细胞外铁来健康和生长,普遍表达普遍表达的数千个受体。由于转铁蛋白的能力,已鉴定为纳米颗粒和小分子的治疗剂被鉴定为纳米颗粒和小分子,并且作为用于通过其受体进入细胞的分子的天然载体。188jinbaobo1

鉴于转铁蛋白的成功作为分子载体,使用转铁蛋白的使用仍然依赖于血清血清或人血清的血清衍生的转移素。两者都受到许多不利因素,例如血清中存在的偶偶代理,对供应链的限制,或由于需求提高成本。因此,我们开发了一种用于使用未衍生自血清或动物血液的重组人转移素的方案。

虽然已经识别出转染过量的转化素以增加转染效率,但2我们表明,与低水平的转移素和血清衍生的转移素相比,在粘附细胞转染期间,在粘附细胞转染期间添加过量的无血清转移素改善了转染效率。我们还表明,在慢病毒的病毒生产增强功能性病毒滴度中纳入瞬时转染转染r型转染蛋白。我们的数据表明,无血清和无血液转化素可用作核酸的载体,并且可能是将分子贩运成细胞中的其他分子。

方法

在全白纸中更详细地覆盖了方法,包括细胞类型,传递条件,材料,烧瓶,电镀信息,转染和病毒滴定。请参阅通过无血清和无血液转化素的瞬态转染增强

讨论

在标准条件下,OptiPeak HEK293T.®与在血清条件下复合的血清条件下进行的转染相比,实现了等效的转染效率。用Optimem复合的GFP阳性细胞的平均百分比和DMEM + 10%FBS生长为42.6%±8.1%,optipeak HEK293T的平均值为48.1%±20.1%(图1,手段的差异不是统计学意义)。包括过量的转移素(Optiferrin.®)在OptiPeak HEK293T的转染介质中,与DMEM + 10%FBS和OptIpeak HEK293T没有过量转化素,将平均GFP阳性细胞显着升高至71.1%±18.8%(图1,p <0.05 by学生T.-测试)。

这些结果表明过量的转移素不会对转染产生负面影响,并且可以增强HEK-293T细胞在无血清化学定义的条件下的转染效率。

HEK-293T的转染效率随过量的转化素得到改善。
图1。 HEK-293T的转染效率随过量的转化素得到改善。误差栏代表标准偏差,*和**表示统计显着性。OptiPeak HEK缩写为Optihek。

为了确定转染效率的转染效率是否与较高的病毒滴度相关,我们对慢病毒质粒进行了瞬时转染,用于用293T细胞进行病毒性生产。在病毒生产转染步骤中的过量转移素导致慢病毒的功能性病毒滴度增加,而无需过量转化素(图2)。Lentivirus生产显示出类似的趋势与GFP记者转染效率测定。第二代Lentivirus载体使用三种质粒体系制备,并且在转染后48小时收获总慢病毒载体。含有OptiPeak HEK293T络合的Lentivirus质粒显示出附近的当量官能滴度,具有来自优选络合的质粒的平均滴度,然后用DMEM + 10%FBS种植的细胞为1.79×107.传染性单位(IFU)/ ml±1×107.IFU / ml(图2)。

功能性慢病毒滴度随过量的转化素而增加。
图2。 功能性慢病毒滴度随过量的转化素而增加。误差栏代表标准偏差。OptiPeak HEK缩写为Optihek,Transferrin缩写为TF。估计的传染性单位(IFU)/ mL是来自三个单独实验的平均官能滴度,每个实验每次重复两项技术复制。

用OptiPeak HEK293T络合质粒,并在化学定义的条件下生长,optipeak HEK293T产生平均滴度为2.3±1.9×107.IFU / ml(图2,手段的差异不是统计学意义)。在OptiPeak HEK293T中络合的质粒含有过量的转铁蛋白,在平均官能滴度中通过OptiPeak HEK293T进行对数增加,平均为3.53±2.8×107.IFU / ml(图2)。

这些结果表明,过量的转移素不会抑制DNA络合,实际上与在没有过量转化素的化学定义的条件下改善了功能性慢病毒滴度,并且与血清衍生的转移素相比,与诸如Optimem中的血清衍生的转移素改善官能滴度。这里显示的改进具有过多的转移素表明293T细胞可以从络合介质中更快地细胞内核细胞DNA。这里显示的改进的另一个假设是,在细胞内被贩运到细胞核中最好地保护质粒DNA。

无论机制如何,无血清,无血,重组人转移素能够实现高转染效率和高病毒滴度,表明无血液转化素在化学定义的培养基中具有高官能度

要了解更多信息,请参阅完整的白皮书通过无血清和无血液转化素的瞬态转染增强

关于作者

索非亚Pezoa.Sofia Pezoa,博士学位,细胞文化科学家,Invitria

Sofia Pezoa是Invitria的细胞文化科学家,她在那里致力于制造基于病毒疗法和疫苗的病毒载体的产品开发。在加入Invitria之前,Sofia在Collado Anschutz大学获得了细胞生物学,干细胞和发育生物学研究生计划的博士学位。

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