细胞治疗制造的发展——早期和现在的程序

虽然细胞治疗(CT)通常在一个阶段中随意提及,但实际上涉及到了相当广泛的医疗治疗。在欧盟,它们可以称为细胞型药物(CBMP),一种先进的治疗药物产品(ATMP)。在美国,CBER继续澄清诸如人体细胞和组织基础产品(HCT/Ps)和细胞治疗药物(CBMP)等概念,涉及最小操作、其他成分组合、系统效应和代谢活性依赖物。

治疗方法的区别包括自体和异体方法;采用的电池类型;所需的任何激活、转导或工程;细胞培养方式;治疗适应症。我们都知道T细胞和用于治疗的多种干细胞。但事实上,许多先天性或获得性免疫细胞以吞噬活性、抗原呈递能力、灵活的表型或组织迁移而闻名,现在正被作为治疗剂。单采外周血的细胞包括T细胞、自然杀伤细胞(NK)、诱导多能干细胞(iPS)、巨噬细胞、γδT细胞(g∂T) 骨髓浸润淋巴细胞(MILs)和肿瘤浸润淋巴细胞(til)以及造血干细胞或间充质干细胞。

有些已经通过病毒转化或CRISPR-Cas9等手段被改造成多种治疗技术,如嵌合抗原受体(CAR)T细胞,甚至二聚体抗原受体(DAR)T细胞,并被应用于多种炎症和增殖性疾病的治疗。总的来说,细胞疗法的实际生产虽然规模较小,但与单克隆抗体等蛋白质生物制品的生产相比,是一个更为复杂和劳动密集的过程。

在这个由两部分组成的系列文章中,我们将探讨细胞治疗制造业的发展,包括细胞治疗是如何开始的以及早期的细胞处理过程。从那里,我们看看目前的状态细胞治疗制造和目前的方法。在第二部分中,我们将讨论改进现有工艺的机会,并研究将把该行业带入未来的未来细胞治疗制造业。

早期

毫不奇怪,细胞治疗工艺向商业规模生产的转移开始时相当尴尬。首先,为干细胞和CAR-T细胞等先进疗法开发的细胞培养、修饰和扩增程序(令人惊讶的是)始于20世纪80年代末,当时的技术按照今天的标准相当原始。这些早期程序的特点是手工贴标签、手工配药、基于纸张的跟踪、有限的分析和经常使用的数据池。由于这种“过程就是产品”的思维方式,不可避免地减缓了新的工程和细胞培养程序的结合。

例如,罗森博格早期过继转移疗法中使用的TIL生成过程的特点是内部生产的材料,在高度专业化的医疗中心实验室的生物安全柜中进行操作。在这里,非冷冻保存的病人的肿瘤活组织切片通常被切成小块,在酶混合物中孵育,收获的浆液通过金属丝网过滤去除组织块。从滤液中分离TIL培养物,然后用IL-2在24孔板中人工传代。然后用T烧瓶或塑料袋扩增TIL,有时用条件细胞培养上清或与辐照饲养细胞共培养[1.].

当前状态

虽然骨髓移植可能被认为是最成功的细胞治疗,但在新开发的基于细胞的免疫疗法中,临床应用最先进的是干细胞和CAR-T。大约十年前,在CAR-T中,我们开始看到不仅出现了新的抗原受体工程技术,而且出现了在CAR疗法中招募的细胞类型。同时,我们也看到了细胞处理设备、分离和扩增方法、分析和冷冻保存技术的重大发展。

目前的一些治疗方法可能是在床边,在医疗方面− 但是,目前许多人赞成集中制造方法,即将取出或生物制品运至新鲜或冷冻到集中制造地点。在这里,细胞产品被制造,冷冻保存,并被运送到诊所,以供病人输液[2.].

许多细胞治疗的制造工艺和设施方面与其他生物制剂的相似[图1、2]. 例如,在生物反应器中进行细胞的扩增以获得免疫特权的MSCs等异基因细胞治疗,与哺乳动物细胞培养用于疫苗非常相似,最终可能需要类似的生产规模[3.]. 然而,其他方面却截然不同。细胞治疗的一个特点是,最终产品不能像单抗或酶制造一样被过滤消毒。随着个体细胞疗法的发展,对其制造的考虑也变得更加多样化。隔离、安全壳和材料流过设施的要求可能导致重大设计变化。例如,多个患者样本或传染材料的分离可以确定隔离要求。

图1.生物制造设施一般要求

  • 更衣室:个人气闸(PAL)和材料气闸(MAL)
  • ISO分类和cGMP合规性
  • 暖通空调、送风和气流模式
  • 温度湿度控制
  • 环境监测
  • 无菌处理要求
  • 污染物和微粒控制
  • 关键公用设施(以及冗余或备用电气设备)
  • 工艺公用设施(注射用水,CO2.压缩干燥空气等)
  • 设施规模(取决于所需功能和外包)
  • 自体或异体及其相关生产工艺布局
  • 所需的专用设备(如生物反应器、离心机、低温保存)

图2细胞治疗中常用的设备

  • 一氧化碳2.、湿化细胞培养箱
  • 抗体细胞分离装置
  • 用于细胞处理/培养/生产系统
  • 生物安全柜和/或无菌安全壳隔离器
  • qPCR、流式细胞仪或ELISA/PAGE
  • 支持白细胞分离的离心机
  • 实验室显微镜
  • γ辐照器
  • 流式细胞仪

支持这些疗法的CBMP的制造可能需要特殊的接收和运输、先进的监管链和跟踪/追踪、特殊的监管考虑、独特的自动化一次性使用系统、开放或封闭系统处理、冷冻保存,大规模或多个小型细胞培养操作。它现在可以采用舞厅,过程自动化,独特的后培养或下游加工和先进的实验室测试。操作套件旨在处理所需的清洁和消毒,其环境分类遵循产品的性质和使用的工艺设备。CT设备设计需要仔细考虑基于科学的安全和监管标准。例如,在制定成套设备规范时,封闭和自动化流程允许减少成套设备的分类,就像在无菌安全壳隔离器中运行的流程一样。

在过去的几年中,CBER的OTAT(组织和高级治疗办公室)和EMA许可和批准的细胞和基因治疗产品的数量有所增加,并且正在审查的提交数量也有了很大的增长。虽然在商业规模的制造业中提出了一些相当大胆的倡议,但对于许多人来说,在工艺放大、套件设计和设施体系结构方面通常仍然是一种保守的方法。下面是对当前操作的某些流程类别的概述。

样品接收

对于自体治疗而言,接收、编目和管理数以百计独特的患者细胞需要专门的流程和设施。处理此类疗法的第一步是将样本从非受控环境中受污染的集装箱转移到受控环境中的无菌设备。在运营初期,我们并没有考虑大量生产,即使每年2000批,也只相当于每天几批− 尽管这种情况预计很快就会改变。

培养基制备

液体介质和粉末介质及缓冲液的使用设施有很大不同。用于大规模培养的粉末培养基需要能够处理粉末配方和过滤的套件。此外,还需要空间用于生产中使用的封闭和/或集成系统的无菌液体的QC测试、转移和分配。如果液体产品采用适合规模的容器(这在当前规模的制造中是常见的),则不需要上述任何一项,但必须为其储存和组织设计足够的冷藏空间。

媒介生产

对于需要载体的过程,目前在基因载体的选择、生产方法和生产地点方面有许多选择。它们包括裸DNA和纳米结构的各种来源、电穿孔、微流控以及在哺乳动物和昆虫细胞中产生的重组病毒载体。很少有CT赞助者有能力、专业知识或资源来制造病毒载体,这就是为什么他们的第三方合同市场不断增长的原因[4, 5]. 许多工作正在进行中的多重重组“生产者”细胞系,但工作仍有待于在这一领域的实际成功− 病毒载体仍然是首选的方法。虽然存在许多病毒载体/动物细胞系,每一种都有自己的优势,但对于CT应用而言,在Hek293中产生的慢病毒和AAV目前最受欢迎。

病毒载体生产的设施要求基本上与某些疫苗生产相同,但具体规模、成套分类和下游序列配置除外。纳米颗粒、腺病毒、慢病毒和AAV病毒的正式BSL分类各不相同。病毒BSL分类中的因素包括1)病毒家族和亚家族,2)任何重组插入基因,3)生产手段(如辅助病毒),以及4)任何工程衰减。例如,具有早期慢病毒的个体活动必须至少在BSL-2、增强的BSL-2或BSL-3下进行;但是,如果包括某些转基因,或者在生产过程中使用了辅助病毒,则可能需要抑制BSL-2。由于这些原因,并且为了提供适应过程或病毒变化的灵活性,许多赞助商默认使用更高的BSL分类。遏制要求和手段由个别机构、联合体和委员会提出,如国家卫生研究院重组DNA咨询委员会(RAC)在“慢病毒载体研究的生物安全考虑”等文件中提出[6.].

临床试验中的大多数载体来源于病毒,尽管一些赞助者正在开发,例如,由合成靶向纳米颗粒提供的转座子载体。显然,每个系统都决定了自己的制造过程和要求。直到最近,许多病毒载体的制造还需要在多托盘静态塑料器皿、滚筒瓶、立方体、多层细胞工厂、搅拌槽生物反应器或可伸缩固定床反应器中的微载体中进行粘附细胞培养[188jinbaobo7.]. 但这种情况正在改变,目前用于产生病毒载体的大多数细胞系都是悬浮适应的。此外,无菌性、再现性和制造人员安全的要求正在推动半封闭和半自动化制造工艺的发展。

虽然使用悬浮适应细胞系可以获得高滴度的载体,但在规模>200L的悬浮细胞瞬时转染方面存在挑战,并且在常规载体生产中尚未广泛采用大规模使用悬浮细胞的方法。

治疗性文化扩张

细胞扩张的目标是一个简化的,健壮的,符合GMP的方法。步骤在特定的细胞疗法之间以及特定疗法的个体实施之间是不同的− 我们可以看到不同的细胞培养活动。例如,在CAR-T过程中,我们看到1)培养选定的单采患者细胞以激活和转化,2)扩增激活和转化的患者细胞,以及3)在某些情况下,扩增的患者细胞团与辐照抗原表达的饲养细胞系共培养。

很明显,这些多重处理步骤会变得相对复杂。这对有效性和再现性提出了至少两个挑战。首先,由于原代患者细胞样本是唯一的,并且在多个参数中高度可变,因此该过程必须是动态的,并且对特定培养物的特性和性能作出响应。第二,每一步都有单独的潜在操作员错误风险。因此,赞助商和签约合作伙伴正致力于开发更优化和自动化的协议和设施。这将有助于降低成本和错误风险,同时提高标准化和再现性。

一些CT涉及悬浮液(如CAR-T)和一些粘附细胞培养(如间充质干细胞/基质细胞、成纤维细胞和成肌细胞)。在这两个系统中工作的复杂性已经得到了极大的审查[8.]. 人们还希望通过灌注培养系统加强这一过程。

在大规模(大于几公升或多层烧瓶)培养同种异体免疫特异性细胞的过程中,我们希望看到蛋白质生物制造领域熟悉的上游套件和设备。采用熟悉的主细胞和工作细胞库、培养扩展序列、大规模培养和过程监控方法。在自体细胞治疗中,患者特异性细胞的个体来源和特征以及非常小规模的培养(<20L)是最显著的差异。最后,我们现在看到广泛采用商业分布的半自动培养仪器[表3].

基于一次性系统的流程很常见,使用无菌SU烧瓶、瓶子、袋子、管道装置、过滤系统,甚至自动化系统。这些组件通常体积庞大,因此需要专门的存储空间,以避免过度堆放和相关的损坏风险。整个制造过程污染控制策略(CCS)的一个关键方面是组件组装前和组装期间的处理、准备、相关卫生处理和检查区域。对于关键操作,例如药品的灌装、制备、组装应在高分类环境中进行,可能在不同区域进行,与最终手术的区域不同。如果是这种情况,将组装组件转移到使用区域和相关的消毒制度(例如,手动、VHP表面生物去污气闸)将是关键,并应在CCS中加以解决。

表3.商业化CT设备示例

自体的 综合
自动CGT数据中心
酒窖 细胞穿梭机“工厂进盒”系统
科美尔 无菌过程控制技术
西蒂瓦 Sepax细胞处理/分离系统
旭日电池扩展系统
费森尤斯卡比 Lovo自动细胞处理系统
隆萨 辛烷茧
米尔滕伊生物技术公司 CliniMACS Plus分离系统
CliniMACS Prodigy细胞处理系统
导丝 雷沃斯,COBE 2991号
赛默飞世尔 Nunc电池厂
赫拉安全生物安全柜
威尔逊·沃尔夫 G-Rex公司静态培养体系

分析

许多平台都需要对细胞、病毒和核酸进行定量和分析,并且常常使用相当新型的设备。然而,除了可能具有额外的安全分类(即BSL-2)之外,支持此功能的套件通常很少具有独特或显著的设计属性。进厂原料的质量控制过程与蛋白质生物制品完全相同。活细胞产品的过程中和21 CFR最终产品质量控制和释放测试在小分子或蛋白质生物中是非常独特的,包括确定生产参数的值,如细胞数量和活力,以及与产品相关的杂质值载体能力、细胞CD标记和CAR表达。但是,除了足迹之外,即使是常用的qPCR、流式细胞术或ELISA/PAGE分析也不会带来增加的设施或套件设计或服务挑战。此外,病毒载体的表征和定量方法也有了实质性的进展[9].

冷冻保存和运输

CT细胞材料和产品的转移通常需要冷冻保存。无论是将收获的病人细胞运送到生产现场,还是将被操纵的药物成分运回诊所,都需要同样的无缝运输。集成,一次性冻融系统可以提供效率和鲁棒性,可能有很少的材料或时间可用于第二次尝试。对于大规模的异基因细胞处理,建立了支持产品半自动等分的设施。对于自体治疗,这涉及到高度控制的分配和标签到小瓶或冷冻袋。对于单个体积或其他特性的独特批次,很难将填充程序自动化到单个冷冻袋中。

自动化、半自动化和机器人技术

自体疗法,特别是传统上,需要许多技术熟练和技术经验丰富的个人。由于在容易发生人为错误的开放系统中执行了许多操作,因此需要经常进行培训。商业化半自动化系统的可用性,甚至CTs中的机器人技术的出现极大地提高了其安全性和效率[表3].

设施灵活性

大多数新的构建都包含了专有的模块化洁净室系统。许多模块化设计包括墙壁和天花板系统,带有齐平安装面板,支持易于组装和拆卸,以及需要的清洁和消毒。工作环境分类既遵循产品性质,又遵循所使用的工艺设备。现代设施设计需要仔细考虑科学的安全和监管标准。封闭和自动化过程需要大幅减少套件分类,就像无菌安全壳隔离装置中操作的过程一样。

结论

细胞治疗制造工艺起源于几十年前的早期程序,采用我们现在认为相当原始的技术和设备。目前的方法有些不同,成熟的赞助商采用了一些最新的细胞分离、工程、分析和半自动化培养方法。我们正处于一个成熟的状态,许多申请,一些重要的批准,以及令人兴奋的新生产技术和设施设计方案的承诺。

请继续关注我们讨论的第二部分,细胞治疗制造业的发展——进步的机会和未来的方向

特色图片来源:Flickr用户NIAID

关于作者

William Whitford,生命科学战略解决方案负责人,DPS组

比尔·惠特福德是生命科学战略解决方案领导者为DPS集团,一家全球咨询、工程和施工管理公司。他协助制定创造性的战略,支持制造经典和创新的生物治疗。比尔开始他的载体作为研发领导者,商业化超过40种不同的产品,支持生物医学和生物制造。最近,比尔一直是一位思想领袖,他确定了新兴的生物医学产品和工艺。比尔出版了300多篇文章、书籍章节和生物制品专利;是国际公约的定期主持人;是生物制造学的讲师。188jinbaobo

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