用于基因治疗制造的病毒载体分析的进化

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《基因治疗成功制造和商业化的见解》

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在美国和全球临床试验中有超过350个细胞和基因疗法,该领域的爆炸性增长预计将增加未来几年。1、2从临床开发对产品许可证的这种快速进展导致病毒载体供应瓶颈。病毒载体制造能力的挑战估计比支持当前和未来的商业供应要求所需的程度为1-2的数量级。3.随着监管审查和产品表征要求正在增加,随着更多基因治疗产品达到商业化。

为了满足这些需求,病毒载体制造过程需要演变变得更加复杂,因此也是评估它们所需的分析工具。对于病毒载体分析/表征和严格的质量控制测定的持续改进和采用快速,强大的技术,对于促进及时发展需要它们的基因疗法至关重要。2

由于其潜在作为治疗疗法,速度到市场速度可能是细胞和基因治疗区段中最重要的方面之一。这些疗法中的许多疗法有资格获得孤儿药物状态和/或快速轨道指定状态,从7到10年(传统生物学)显着缩短了药物开发时间表到3至5年,为制造商提供了更大的压力来减少生产时间表。4.对于病毒载体开发人员来说,需要跟上这些加速时间表所需的分析方法将需要克服基于实验室,经典技术的局限性,以便提供产品特征和质量测试,以便于过程中的优化努力。

在这里,我们与行业专家进行了交谈,以了解在过去几年里,随着病毒载体制造商实施过程分析技术(PAT)变得越来越普遍,分析工具的前景是如何演变的。分析过程已经成熟并变得更加精细,但仍有很多地方需要改进。重要的是,作为一个行业,要评估如何最好地向前推进,以填补现有的知识空白,无论是从其他更成熟的生物生产系统学习,还是投资于新颖的创新技术。

病毒载体分析的当前挑战

病毒载体分析的当前挑战

随着更多基因治疗产品被批准和生产的技术变得更加成立,增加了对更大敏感性,特异性和准确性的监管期望超出了现有分析技术的限制。需要远离实验室规模,“尝试和真实”技术,这些技术缓慢,吞吐量低,通常具有差的可再现性和精度的可变性。这些方法应替换为更强大,快速准确的测定。

通过设计的质量(QBD)框架在质量范围内推动了对高质量分析的投资,这可以产生更接近的“实时”数据,这些数据可以通知过程开发决策,以实现更高的产量并改善病毒矢量安全概况。采样与传统检测结果之间的滞后时间有时是几天到数周,这对于实验(DOE)的有效设计是令人满意的。此外,这些测定可能缺乏显示逐步处理优化可能导致的细微变化所需的分辨率。在纳入新的分析工具的同时是病毒载体产生的关键目标,但认识到这些方法需要验证,然后在监管机构可以使用临床制造。因此,它们在研究和过程开发中的使用是至关重要的,这不仅仅是为了使迭代能够改善制造过程,而且还可以验证这些方法可以满足监管需求。关键将是使用适当的控件的并行正交方法,以确保数据的完整性。

病毒载体分析方法的发展

2020年1月,FDA发布了修订后的细胞和基因治疗管理指南。在病毒载体分析的情况下,针对杂质、复制、滴度和传染性对分析程序进行了更改。5.总的来说,FDA需要这些参数更详细的信息/特性描述和FDA监管文件,预计随着该领域的成熟和开发的继续,这些参数只会增加。

描述病毒载体特征的分析工具随着行业变化的需要继续发展,但当前监管指南中反映的五个主要质量支柱没有变化。FDA的化学、生产和控制(CMC)指南规定的病毒载体生产的关键质量属性(CQA)包括:身份、力量/效能、纯度、安全性和稳定性。这些控制有助于量化有病毒载体观察到的产物异质性,以确保安全性和功效,这对于基于细胞的基因疗法尤为重要(图1)。

病毒矢量制造的广义工作流程。
图1。病毒矢量制造的广义工作流程。

很明显,在各种分析技术中的专业知识是检测和表征生物制药及其杂质(产品和过程相关的杂质)所必需的。在许多情况下,病毒载体制造商可以利用证明其在生产单克隆抗体(MAB)中的有效性的技术,其中一些将在此讨论。然而,对于大多数这些较新的,更复杂的分子,必须开发定制的测定,请牢记其速度,准确性和稳健性。4.

质量 属性 示例测定 下一代测定
身份 遗传标识 基因组测序(NGS)PCR
蛋白质标识 SDS-PAGE. CE-SDS.
质谱(MS)
Western Blot(免疫印刷) 自动Western Blot.
强度/效力 物理病毒滴度 ELISA Madls.
QPCR. ddPCR
光密度(A260 / 280)
NanoSight
HPLC(AAV包装比率) CE-SDS或CE-LIF(AAV包装比率)
功能病毒效价 斑试验 欧洲互通性系统委员会——阻抗
荧光疫源地分析
TCID50(终点稀释试验)
纯度 工艺杂质(洗涤剂、树脂) 女士
色谱法
TEM
主机闲暇的杂质 宿主细胞DNA/RNA: Picogreen, DNA阈值测定,qPCR
宿主细胞蛋白:SDS-PAGE, ELISA, HPLC, TEM LC-MS,LC-MS / MS
衣壳含量(空:全衣壳) ELISA / QPCR.
HPLC. CE-LIF,总主任(等电焦点)
女士
TEM
AUC
安全 不育 标准无菌测试(EP 2.6.1,USP71) 快速微生物法(RMM)
内毒素 兔热原测定法(EP 2.6.14, USP85) 重组因子C(RFC)
支原体 基于细胞的测定 QPCR.
复制竞争力病毒(REP / CAP序列) 南方斑点QPCR.
不定位代理人 体内和体外细胞分析
稳定 pH值 电位法
渗透 osmometry.
汇总形成 光学显微镜
DLS. Madls.
SEC-MALLS TRPS
TEM
AUC
FFF-MALS.

表1。用于评估病毒载体CQA的电流和下一代分析测定的实例。

身份

遗传标识。使用分子方法,例如PCR和基因组测序(高通量NGS),以确认载体基因组的身份。

蛋白质标识。衣壳蛋白的全面表征对病毒的感染性和载体效能至关重要;因此,血清型鉴定、衣壳蛋白化学计量和完整性不仅有助于扩大产品知识,也确保产品和工艺的一致性。6,7.可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA),蛋白质印迹(免疫印迹)或质谱(MS)方法来确定AAV血清型。与MS类似于LC(液相色谱)和Ce(毛细管电泳)和Ce(毛细管电泳)-MS的色谱和电泳分离技术都用于肽映射,其中LC-MS最常使用。因为CE-MS将肽部分与LC-MS分开,所以它用作有价值的正交和互补技术,以提供衣壳蛋白更完整的分析。8.

十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是常用的良好表征的测定,以确认病毒载体化学计量(包装比率),但它遭受差的分辨率和测定变异性。毛细管电泳 - 十二烷基硫酸钠(CE-SDS),其是常规使用的,用于MAB质量控制的良好熟悉的工具,是与SDS-PAGE相比的更精确的方法,包括自动化,改进的分辨率,再现性和吞吐量能力和吞吐量是一种更合适的基于仪器的替代品,越来越多地在病毒载体分析工作流中实现。9.

诸如AAV-ID的新方法,其中差分热稳定性用于区分AAV血清型和HILIC-FLR-MS方法,其采用亲水性相互作用色谱(HILIC),然后荧光(FLR)和MS检测是蛋白质的有希望的技术表征,需要进一步分析和验证以确定其在QC工作流程中的实用程序。7、10

强度/效力

根据FDA 21 CFR 210.3(b)(16)指导,强度定义为:

  1. 原料药的浓度(例如,重量/重量、重量/体积或单位剂量/体积基础)和/或
  2. 效力,即药品的治疗活性,如适当的实验室测试所示或通过适当地发育和受控临床数据(例如,通过参考标准表示单位)。

生物制药,力量通常被视为等同于强度定义为“特定的产品的能力或能力,表明通过适当的实验室检测或充分控制通过临床资料的管理产品的方式,来影响一个给定的结果。”11.应在产品开发过程中验证效力测定。只要有可能,效力测定应测量表达基因产物的生物活性,而不仅仅是其存在。

物理滴度。物理滴度是完整病毒体积的测量 - 在给定的制剂中存在多少,并且表示为每mL(Vp / ml)的病毒颗粒的数量,或者AAV作为每mL(GC / mL)的基因组拷贝。188jinbaobo

基于量化病毒基因组或病毒蛋白质的浓度,有多种方法用于确定病毒的物理滴度,包括ELISA,光学密度测定(a260/280)和更复杂的可视化系统,如用于病毒粒子定量的NanoSight设备(Malvern Instruments Ltd.)。高效液相色谱(HPLC)允许可视化和定量完整的病毒颗粒在异质制剂,也包含细胞和过程污染物。188jinbaobo

到目前为止,最常规使用的物理滴度测量方法是基于实时PCR的测定,因为它们是坚固,简单,快捷方便的。在该行业中,现在存在从定量PCR(QPCR)转移到数字液滴PCR(DDPCR)以测量此属性。使用DDPCR,将样品分成数千个单独的微反应,该微反应量在Taq聚合酶扩增的终点下量化为PCR阳性和PCR阴性。这使得能够直接和绝对地定量靶DNA,其在检测中具有更大的灵敏度和比QPCR的可变性更少,这需要与标准曲线进行比较。DDPCR产生更精确和可再现的数据,特别是在存在可以部分抑制Taq聚合酶和/或底漆退火的样品污染物的存在下。12、13这使得它不仅对最终产品特性有用,而且对过程中分析,载体准备更异构。

传染性或功能滴度。功能性滴度或传染性滴度是一种感染性的量度 - 有多少病毒颗粒实际上可以感染靶细胞。188jinbaobo传染性或功能滴度几乎总是低于物理滴度,倍数为10%至100倍,因为并非所有生产的病毒产品都是功能性/传染性的。病毒载体的传染性滴度也可以通过病毒溶液的冻融改变,因此监测稳定性测试期间的强度/效力是相关的。

传染性滴度通常用体外细胞转导试验,如病毒菌斑(用于细胞病变病毒),终点稀释(tcd)50.),免疫荧光灶(IFA)。14.对于表达荧光转基因的载体,FACS可用于定量功能效价。虽然仍然被认为是测定功能效价的“金标准”,但基于细胞的测定是耗时的,并且具有高可变性。例如,一些AAV血清型不能很好地转导体外因此,可能会导致低估感染滴度。

用于研究细胞生长和迁移的电池 - 基质阻抗检测(ECIS)或实时细胞分析(RTCA)方法在确定病毒感染滴度方面具有效用,特别是在疫苗发育中。这种无标签方法是基于测量在镀纸中形成的组织培养皿中的电路的电阻抗的实时变化,该电路镀与感染病毒感染的细胞。15,16.生物传感器监测宿主细胞形态的变化,以及作为病毒细胞病变效应的一部分发生的细胞-底物附着。当细胞被病毒感染时,它们变得更容易接受电流通过,测量结果是阻抗随时间的减少。与传统的细胞检测方法相比,该检测方法大大提高了检测结果的时间,并成为一种更强大、更快速的实时病毒感染定量方法。

纯度

病毒载体纯度要求很高,只有在基因疗法变得更加成立并且正在为更常见的适应症和更大的患者群体开发而增加。可以将来自上游和下游操作以及生产细胞系的杂质引入载体制剂中,并且必须被仔细监测和量化,因为它们可以具有意外的免疫原性作用。

过程杂质。上游杂质的例子包括细胞培养基成分和添加剂,而洗涤剂、残留色谱树脂和其他化学品可以通过下游净化过程引入。通常,下游澄清会去除大量杂质,但<1000nm的分子仍以微量存在,因此,监管机构需要对其进行定量,这通常使用MS和HPLC方法实现。

生产杂质。在该类别中包括不需要的宿主细胞蛋白(HCP)和来自生产细胞系以及产生治疗载体所需的任何辅助病毒和质粒的核酸。可以使用像picogreen,DNA阈值测定和QPCR等测定检测宿主细胞DNA / RNA。

经典的HCP检测使用ELISA提供了总HCP量的估计,但结果是可变的,可能受缓冲液成分和更多的影响。HCP分析的主要挑战是低浓度HCP的测量和分析的重现性。因此,卫生当局也要求使用诸如CE、CE-MS、LC-MS和LC-MS/MS等方法作为ELISA的正交方法,以鉴定HCP。17.这些方法也可以提供快速分析衣壳蛋白比例、衣壳蛋白结构和转基因长度的方法,以便在工艺开发和工艺测试过程中快速决策。18.

此外,与病毒载体产品本身相关的杂质是病毒载体开发人员特别关注的问题,因此衣壳含量的单独表征是一个主要的重点。

衣壳内容。正如行业专家所强调的那样,衣壳内容表征是一个挑战,在分析方面是一个最需要开发的领域。在病毒载体的生产过程中,会产生大量无法正确包装载体DNA的病毒粒子。188jinbaoboVector-related杂质包括:

  • 空囊囊
  • 含有除所需载体基因组之外的核酸序列的衣壳
    • 非法,非载体DNA(来自转染质粒,宿主细胞或辅助病毒)
    • 截短的矢量基因组
    • 复制主管病毒

表征这种属性的一个挑战是,空,完整和部分全衣壳颗粒之间的衣壳的尺寸和形状几乎没有变化。188jinbaobo估计封装的DNA杂质可能超过粗收获中的含有载体基因组的含有载体的AAV颗粒的10%。188jinbaobo19.因为它们非常类似于实际的载体产物,所以将载体相关的杂质在下游纯化中的合法载体中难以(用于空衣壳)几乎不可能(对于一些被封装的DNA杂质)。这些不需要的载体相关的杂质代表临床载体产品中的异质潜在免疫原性材料的群体,这可能会影响患者安全性,因此需要增加审查。

常用的策略以确定载体制剂中的全衣壳的百分比是通过从ELISA或光学密度获得的总衣壳数(A.)将从QPCR数据获得的基因组载体的数量分开(a260/280) 数据。20,21其他方法包括MS、HPLC、透射电子显微镜(TEM)、尺寸排除色谱(SEC)和分析超离心法(AUC)。然而,这些方法中的许多都不能解决部分完整的衣壳,这就需要一种具有更高分辨率的技术。13,22SCIEX开发了一种使用PA 800加药物分析系统的毛细管等电聚焦(CIEF)方法,该系统利用不同的等电点(PI)来分辨满,空和部分衣壳以确定它们在载体制剂中的比率(图2)。样本分析时间为每种样本小于1小时,并且能够通过多个AAV血清型产生可靠,可重复的,高分辨率的结果。23.用cIEF法计算衣壳比与正交法HPLC法和AUC法比较。SCIEX平台通常用于其他生物制剂的质量控制,使其很容易过渡到病毒载体制造流程。

Sciex毛细管等电聚焦方法
图2。分析了两个相同AAV产品样品的凸型谱分析了不同量的全毛囊的含量不同。样品#1富含空衣壳,而样品#2富含全衣壳。对于AAV满和空衣壳,完整的衣壳具有比从壳内封装在壳体内的SSDNA所贡献的负电荷所贡献的负衣壳的较低的PI值。由于其中等PI值,一些潜在的部分衣壳峰似乎坐在那些空和完全衣壳峰之间。(图是Sciex的礼貌)

安全

病毒载体产品的药典安全性检测包括无菌(USP 71)、内毒素和支原体检测,以及任何能复制的病毒和其他外来制剂的检测。

不育。标准的为期两周的测试期是一种挑战,可以调和,即时释放基于细胞的基因治疗所需的病毒载体,例如汽车T,制造流水线,这些管道通常具有狭窄窗口的临床应用。FDA和其他监管机构(EMA,PMDA和ICH)通过2012年通过修正案,通过修订这些新技术(表2)来承认这种变化的景观通过2012年的21 CFR 610.12条例的修正案来允许使用交替的快速微生物方法(表2)而美国药业转子公约正在开发一种新的章节,可用于快速无菌测试。24.

分析 方法 仪器 lod(cfu / ml) 期间
ATP生物荧光 荧光素酶测定:测量不同微生物的ATP输出 Biotrace 2000
Pallcheck快速系统
Milliflex快速系统
Celsis Crapiscan.
Biomaytector.
103 30分钟
流式细胞术 在最初的24-48小时富集步骤后荧光标记活菌细胞的检测 Bact-Flow.
Facsmicrocount.
10-100 6-8小时
等温Micro-calorimetry 测量微生物代谢引起的热输出。 TAM III量温计
BIOCAL 2000等温热量计
48-challen等温
微量微量仪
104 2-7天
核酸扩增 使用通用引物进行蜂窝RNA的RT-PCR;可以与基于生长的富集阶段一起使用或没有基于生长的富集阶段使用。 多个温度计和放大器分析仪 10 - 1000 2 - 4小时
呼吸 诸如呼吸仪,气态顶空分析仪和自动血液培养系统等仪器可用于检测和枚举呼吸微生物。 Promex Microrespirator 4200.
Bactec系统
BioLumix BacT /警报系统
EBDS PALL系统
tdl
1 - 10 隔夜- 7天
固相细胞计量 结合荧光标记和固相激光扫描细胞技术,可在过滤液中快速枚举活菌。 ScanRDI®系统
BioSafe分
Muscan系统
1 - 10 2 - 3小时

表2.。发明内容六种拟议的分析平台作为传统测定的替代品,用于拓展快速性测试(适应Bonnevay,2017)。

RMMS是手动测试的越来越常见的替代方法,而这些方法均普遍适用于所有产品,它们可以帮助显着降低测试和产品释放时间以及具有更高的灵敏度,吞吐量和数字数据输出。24.

支原体。通常,通过培养和细胞指示剂方法检测支原体污染,这是耗时的 - 至少28天完成。基于快速的实时PCR的测试系统可以提供更短的时间框架的结果,适用于过程开发工作流程的设计(QBD)方法的内容测试。

内毒素。USP目前识别两个内毒素试验,兔热原试验和灰度琥珀细胞裂解物(LAL)试验。重组因子C(RFC)测试可用作替代方法,目前正在通过USP评估。25.

病毒的复制能力(RCV)。病毒载体被设计成复制缺陷,因此产生复制能力病毒的风险很低。虽然发生率低,但这些事件可以发生在载体制造的任何阶段,通过在生产细胞内的重组事件,并可以增加每一个连续扩增。因此,监管机构要求RCV测试以确保最终产品的生物安全性。可被逆转录病毒、lenti病毒或AAV病毒感染的细胞系用于检测RCV体外。Southern blotting或qPCR也用于检测是否存在/扩增rep序列。

稳定

在药物发育的所有阶段进行稳定性研究通常从药物发育的临床前阶段开始,并继续通过I期III期临床试验来支持配方发育,并满足临床试验的监管要求。通常,保质期规范应该从QC释放标准中得出,额外地强调稳定性指示的测试特征和用于降解产品的测试/限制。矢量完整性,生物效力(包括转导容量)和强度是应始终包括在稳定性研究中的关键产品属性。常见问题是在填充后延长储存时的病毒载体聚集和颗粒形成的趋势。诸如AUC,尺寸排除色谱等技术,具有多角度激光散射(秒商场),TEM / CRYO-TEM和动态光散射(DLS),以研究病毒产品的聚集状态作为稳定性测试的一部分。14.

多角度动态光散射(MADLS)是动态光散射技术的一个新发展,越来越多地应用于聚类检测。而DLS测量发生在一个单一的固定检测角度,MADLS测量样品的三个角度。这种组合数据的结果是更少的噪声,提高了分辨率和颗粒分布分析的尺寸精度。26.

可调谐电阻脉冲感测(TRP)是另一个高吞吐量平台,可以促进更准确的病毒载体聚集测量。粒度测量基于阻抗通过纳米孔的阻抗,以产生与TEM结果相当的精确尺寸分布输出(相对于已知的校准标准)。27.

期待:知识差距来解决

我们的专家一致认为,病毒载体的制造基本上和20年前单克隆抗体的开发一样。虽然PAT的发展一直很缓慢,但它确实在大量投资推动分析工具开发的利益相关者中获得了势头。当然,我们可以利用抗体生物生产放大过程中获得的知识作为如何处理病毒载体的路线图。利用可应用技术的能力有助于简化流程开发时间。

需要实时或接近实时分析测定来监视诸如滴度,CAPSID内容和聚合等键属性,以支持PAT。这些快速分析工具将允许在过程中,当与预测分析结合时,可以提供实时反馈控制,以减少工艺开发循环时间,以获得产品质量改进。最终这些方法可以将速度提高到新的治疗性的市场。如果特定属性超出规范,这也可以在做出关于病毒载体批量的前进进展的决定性的。过程中的数据可以确定是否继续批量运行,这有助于最小化批量故障并降低商品的成本。

预测分析汇集了数据挖掘(当前和历史数据)和机器学习,以生成关于在制造过程中会发生什么的预测模型。此外,通过传统的分析工具(如自动Western Blots和ELISA)的允许使用自动化分析工具,生产数字输出,允许自动跟踪和处理数据。这种自动化不仅降低了劳动力成本,而且还可以在过程中开发过程中更快的迭代。管理自动生物过程,商业计算机化平台的数据收集和分析具有通过提供实时反馈控制来推进过程开发和优化的速度。这更适合连续,可扩展的制造工作流程。在一起,这些下一代分析工具可以促进创建灵活,高效,经济高效的开发,支持灵活和精简的制造过程,使治疗方法能够更快地达到市场,以满足患者需求。

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