细胞和基因治疗的质粒DNA产生

高质量的质粒DNA是细胞和基因治疗制造中的关键组分,因此需求量很高。这导致需要优化制造,以满足对体积的需求以及用于制造治疗方法所需的质量。质粒DNA(PDNA)制造由于其大尺寸,剪切敏感度,高粘度和PDNA之间的相似性以及在制造期间存在的杂质之间的相似性而面临的几个挑战。因此,了解该过程的所有领域对于以大规模成功的制造至关重要。

具有高需求和质量要求,重要的是寻找可以照亮PDNA关键优化机会的领域的专家,并回答有关生产问题。为此,请咨询专家会议,我们组建了一支专家团队,回答关于细胞和基因治疗应用的质粒DNA生产问题。

符合我们的专家

Nargisse El-Hajjami,Phd,副主任,EMEA段开发用于细胞和基因治疗

分子微生物学家和生物过程专家具有10年的科学研究,过程开发和生物制造工程的经验。在她目前的作用中,Nargisse El Hajjami博士专注于通过领先的战略举措,支持上市战略,支持客户建设,增长和优化其知识和制造流程的核心和基因治疗业务发展。

Laurens Vergauwen,流程开发科学家

Laurens是一个下游加工专家,支持客户的发展和优化各种下游净化技术(色谱,TFF,澄清,无菌和病毒过滤)。能够使用不同类型的制造商,Laurens Vergauwen对不同种类的生物制药净化策略的强烈了解,包括质粒DNA。Laurens举办了Leuven大学(比利时)的工业生化工程硕士学位,他的主要激情正在分享知识。

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问题1

是否有任何关键媒体成分来提高生产率?

几个参数可以影响母细胞组织选择,生长速率,培养基,饲养率以及适当的生长条件和参数,如pH,渗透压,光学密度(DO)和温度等相应的生长条件和参数。

一般介质组合物由碳源,氮源,硫酸镁,磷酸二钾和矿物质组成。可以使用最小和半定义的介质。利用最小介质,可以获得高度可重复的批次。另一方面,半定义培养基可以支持更高的细胞密度作为复杂组分(例如酵母提取物)供应生长因子,氨基酸,嘌呤和嘧啶。

作为碳源,葡萄糖通常使用,因为它有效地代谢和廉价。然而,葡萄糖可能导致醋酸乙酸盐的产生(Crabtree效应)。这可以通过(部分)替代甘油的葡萄糖来避免。甘油还可以帮助支持最大的最大生长率。

通常通过加入复合组分,例如酵母提取物,Casamino酸或佩辛酯来供应氮。

加入硫酸镁和磷酸钾以提供镁,硫,钾和磷源(磷酸盐也用作缓冲剂)。其他微量矿物质存在于培养基的复杂组分中,或者可以通过特异性痕量矿物溶液添加。

质粒产率主要受C:N比的影响。建议测试不同的比率。从2:1高达8:1。对于每个媒体类型,最佳比率不同。

问题2

我的质粒DNA是不稳定的,您是否有关于我们可以促进稳定的内容的任何建议?

一方面,重要的是,您的目标基因(插入物)和质粒(载体)的序列很好地优化。然而,一些质粒本质上是不稳定的。例如,如果插入件非常大并且/或包含反相串联重复。对于大基因,应选择小载体。然而,如果这已经是这种情况,则可能在低拷贝数(在倒置串联重复的情况下相同),可能需要生产质粒。

另一方面,调整生长条件(例如,在较低温度下生长),选择替代宿主,优化工艺条件,并选择用于加工,配方和存储PDNA的右缓冲器,也可以帮助提高其稳定性。

此外,DNase污染和pH对PDNA稳定性产生了很大的影响。DNase可以降解并消化DNA双链,同时极端pH可以破裂,变性甚至改变PDNA序列。因此,为PDNA选择右缓冲器和解决方案是为了保留产品稳定性很长一段时间的基础。最好的选择是具有EDTA的TRIS缓冲器,因为TRIS缓冲液允许控制pH稳定PDNA,而EDTA螯合物抑制DNase活性。

对于储存,PDNA通常储存在-20°C至-80°C,在其中可以保持稳定,并且它也可以在4°C或室温下稳定,但短时间内。

问题3.

为什么GMP质粒如此昂贵,供不应求?

GMP生产总体上更昂贵。这有很多原因。GMP制造期间使用的原料产品具有更高的纯度,纯度较高。需要专用的生产区域(例如洁净室)。清洁方法需要验证,最终的GMP产品具有高纯度,这已通过一系列验证的分析方法确认。

短路供应是由于全球细胞和基因治疗市场的实质性增长,除疫苗和癌症治疗应用外。在过去两年中,在调查的新药数量上报告了大量增加,并且多种药物正在许可商业分配。由于这种增加,提供GMP级质粒的合同制造商正在努力跟上不断增长的需求。最近的大流行加剧了问题,因为正在开发许多疫苗候选者,包括基于DNA的疫苗和基于mRNA的疫苗,其中质粒DNA是MRNA体外转录过程的原料。

问题4.

如何为我的基因选择最好的质粒?

有两种主要类型的载体,克隆和表达载体。克隆载体是生成许多基因副本的理想选择。如果目标是表达感兴趣的基因,则需要表达载体。

对于克隆载体,关键方面是副本编号(取决于ORI),可选标记和克隆站点。通常,优选高拷贝数。注意,当基因对细胞有毒时,或者当质粒不稳定时,低拷贝数可能有利。可选标记允许鉴定阳性转化体。大多数时间这些都将是耐药标记物,但也使用营养缺血性标记物。检查矢量是否包含适合插入的克隆站点是很重要的。迄今为止,大多数载体含有多个克隆部位,这使得载体可能与所选限制酶兼容。

表达载体含有与表达,例如促进剂,核糖体结合位点,终止剂,标签或融合蛋白相关的一些额外序列。这些序列中的一些是特异于宿主生物。因此,表达载体需要与所选宿主生物相容(例如哺乳动物,昆虫,大肠杆菌)。

问题5.

我们看到DNA产量非常差。你有一个很好的协议吗?

为了具有良好的质粒DNA(PDNA)产率,最佳方案是具有稳健的整个过程,其中每个步骤得到很好的优化。由于其相当大的尺寸,高负电荷,粘度以及污染物对PDNA(开放圆形PDNA,基因组DNA,高分子量RNA)具有与污染物相似的事实,PDNA净化是挑战。此外,大质粒对剪切应力敏感,进一步使纯化复杂化。为了用高产率纯化超滤波器PDNA(用于治疗/转染的所需形式),需要良好优化的下游工艺。我们公司拥有下游过程的每一步的解决方案和能力,以确保最佳的PDNA产量和纯度(图1中总结)。下面讨论了每个下游单元操作的考虑和观察。

[标题ID =“附件_23053”align =“SendalCenter”宽度=“800”]集成工作流程,具有从收获到最终填充的PDNA净化的功能图1:集成工作流程,具有从收获到最终填充的PDNA净化的功能[/标题]

细胞收获

电池收获步骤使用离心或微滤TFF。当需要处理批量卷(<10L)或更大的批量(> 1,000L)时,离心通常更具成本效益。使用离心时,在大规模离心中产生的高剪切需要特别注意。微滤可以用开放式通道进行,平板电路板(如Prostak)进行TM值与杜阿佩尔的盒式磁带®0.1或0.2μm微滤膜或颗粒®与杜阿佩尔的盒式磁带®v屏幕或生物脂®1,000 kd V屏幕超滤(UF)膜。开放式进料通道为细胞保留产生温和的流动路径,导致低剪切,并且可用于处理粘性和/或高固体进料。当使用膜截止诸如这些时,重要的是利用双泵(渗透控制)TFF系统。TFF收获步骤通常涉及2-5x体积浓度,然后在进一步下游纯化之前洗涤介质组分和细胞外杂质的3-5体积渗滤。TFF收获通常在低跨膜压力(TMP; 3-5 psi)和Δp(<7psi)下操作,并在渗透通量上进行控制。中空纤维模块也适用,但可以伴随着由于非线性可扩展性而导致的缩放问题。

微过滤TFF的典型操作参数:

微过滤TFF的典型操作参数

细胞裂解

用于细胞裂解的方法可分为两个主要类别 - 化学(碱,洗涤剂,酶,渗透休克)和生理机械(热,剪切,搅拌,超声化和冻融)裂解。碱性裂解(NaOH在pH〜12)伴有洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)和Triton®X-100是最常见的方法。重要的是优化裂解孵化时间,因为它直接影响质粒DNA的质量和量。较长的孵育时间可能导致质粒DNA的不可逆变性和基因组DNA的剪切劣化。在碱性裂解步骤上使用高效但不太侵蚀混合至关重要,以确保没有pH极值导致质粒的不可逆变性或由于过量剪切而降解。莫伊斯®单用混合器对于批量溶解非常有效。

在碱性裂解方法期间,在基因组DNA的特异性窄的pH(通常围绕pH 12)的特异性窄的pH(通常约为pH12)中处理细胞,而PDNA双链保持完整(pH范围为12.0至12.5)。最佳pH值根据质粒和宿主菌株的类型而变化。从最佳值偏差超过0.1 pH单位可能影响产率,因此在碱性裂解期间保持对pH范围的紧密控制至关重要。在pH> 12.5时,PDNA变得不可逆转地变性,如果pH太低,基因组DNA不会完全变性并且可以使进一步的下游净化过程复杂化。标准碱性裂解的孵育时间相当短,并且该步骤通常在5分钟内通常在5分钟内完成。

在碱性裂解之后,将pH中和。这通常通过添加高盐缓冲液,例如浓度为0.7m-3.0m和pH〜5-7.5的钠或乙钾进行,用/不含1.0-1.5%CaCl2(促进RNA沉淀)在洗涤剂(0.2-1%SDS)存在下。聚乙二醇(PEG)和聚乙烯胺也可以加入中和缓冲液中以促进基因组DNA的沉淀。在中和和沉淀过程中均匀混合对于维持PDNA质量至关重要。

澄清

PDNA工艺的澄清单元操作应使得能够从进料流中除去固体含量。可以通过离心和/或正常流过滤进行澄清。传统上,离心用于澄清。使用离心时,应该注意剪切应力,这可能会损害超硅化性质粒的结构,从而导致产量下降。离心也可能需要次要澄清步骤。使用正常流过滤的澄清是现代方法。当使用该方法时,可以使用饲料流,其未经处理,预处理或预制。预处理对澄清过滤器容量产生了重大影响,并且必须仔细选择,并考虑到该过程的可扩展性。预处理选择包括使用重力沉降和分离,多角形®CR1μm/ polygard®CR50μm,袋式过滤不锈钢筛过滤器,纸质过滤器和离心。多体的容量®CR过滤器通常在0.55-8升/英寸的范围内。

推荐的过滤器设置为澄清步骤是:

推荐的滤波器设置为澄清步骤是

过滤器的预期容量强烈取决于是否进行预处理:

过滤器的预期容量强烈取决于是否进行预处理

使用Clarisolve时的典型恢复®和Millistak +.®过滤器> 90%。可以使用含追含量的缓冲液来增加回收。Millipore Express的能力®SHC灭菌级过滤器澄清通常在400-650 L / m之间2

切向流过滤(TFF)

澄清后,可以选择TFF步骤。这将允许渗透和执行渗滤以将培养基交换为适于下游色谱步骤的缓冲液。通过在色谱前进行浓度,可以减少色谱负载时间。此外,在TFF期间可以除去RNA,小尺寸的基因组DNA和小蛋白质,这也有助于防止色谱树脂污染。

执行TFF时,一些关键钟表是:

  • 质粒的剪切敏感性,需要仔细调整过程参数,以防止对质粒损坏。
  • 膜污染,导致产量损失。
  • 高盐缓冲液促进质粒压实,这可能允许通过小孔,导致产率损失。

可以通过仔细筛选推荐的开放频道膜,例如PELLICON来避免这些问题®2 Ultracel.®或生物脂®100或300 KDA C屏幕。通过使用开放通道,可以减少剪切应力。另外,通过适当的膜尺寸最小化处理时间是重要的。当使用这些更宽的膜截止时,通过利用双泵(渗透控制)TFF系统来控制渗透通量非常重要。这将有助于防止膜污垢。

典型的TFF工艺参数是:

典型的TFF工艺参数

色谱纯化

对于色谱纯化,通常使用AION交换色谱(AEC)和疏水性相互作用色谱(HIC)。已经实现了两种技术用于捕获或中间纯化/抛光,并且通常组合。

使用AEX作为PDNA的捕获步骤时,刺破澄清的裂解液与NaCl(120-250mm)有益。这将消除RNA的干扰,从而增加了PDNA的结合能力。补充的最佳盐浓度需要预先确定,例如通过微量滴定板形式的分批测定,测量在增加氯化钠浓度下的质粒结合能力。对于不同类型的树脂/膜吸附器可以这样做。以下图表展示了Fractogel的这一原理®EMD DEAE(M)和Fractogel®EMD DMAE(M)树脂:

[标题ID =“附件_23056”align =“SendalCenter”宽度=“500”]Fractogel®EMDDEAE(M)和Fractogel®EMDDMAE(M)树脂(补充前的原始裂解物:pH 5.0,67ms / cm)[/标题]

推荐的质粒纯化树脂及其各自的性能:

推荐的质粒纯化和各自的性能

由于质粒的大尺寸,通常在市售树脂上观察到低结合能力。这是由于大多数AEX介质最初设计用于蛋白质纯化,因为质粒分子大于蛋白质,它们不能进入小孔,导致低结合能力和慢重传递。因为Fractogel.®和eshmuno.®树脂含有触手技术,通常可以实现与其他可用树脂相比更高的粘合能力。natrix.®Q基于膜技术并含有大型对流孔隙。后者促进了传质并改善了结合容量(5-10mg / ml)。由于膜技术,需要非常短的停留时间(<0.2分钟)。由于这些优点,以及其单一使用格式,它已被广泛采用。

上表中提到的所有四种树脂可用于捕获PDNA。但是,只有Fractogel®EMD DEAE(M)和Fractogel®由于其中等胎圈尺寸(D50:48-60μm),因此,EMD DMAE(M)树脂非常适合于中间纯化或质粒DNA的中间纯化或抛光质粒DNA,以及良好的分辨率(D50:48-60μm),清除像RNA等残留的杂质和内毒素有效。

HIC树脂的实例是CAPTO™质粒选择和TOYOPEARL®丁基。HIC步骤可以位于AEX步骤之前或之后。当HIC步骤是第一色谱步骤时,洗脱液可以直接加工到Fractogel上®作为与这些AEX树脂结合的PDNA结合,耐受升高硫酸铵浓度(PDNA结合能力而不会受到带负面影响的存在)。

Natrix的实验运行示例®Q色谱膜捕获PDNA:

用于捕获PDNA的NATRIX®Q色谱膜的实验运行的实例

最终浓度和灭菌级过滤

色谱后,将样品浓缩并在选择的缓冲液中渗滤。如切向流动过滤部分中提到的相同条件适用。

由于最终产品的大尺寸和粘度,PDNA的无菌过滤可能是挑战性的。此外,大质粒可以是剪切敏感的并且在操作期间可能被损坏。一些关键考虑因素是:

  • 盐浓度:在增加盐浓度时,质粒DNA趋于更紧凑。后者可导致提高产量和过滤能力。
  • 膜型:通常,在使用基于PE的膜时,可以实现更高的过滤器容量和磁通。基于PES的膜也可能对较大的质粒(较少剪切)造成损害。Millipore Express®建议使用SHC进行此操作。
  • 质粒纯度:与开口圆形质粒相比,超硅化性质粒倾向于提供更好的过滤性能。因此,产量和过滤能力均倾向于随纯度而增加。
  • 定义过滤终点:发现表明膜污染与产量损失相关。优化过滤端点可能导致产量增加。
  • 饲料通量或压力不会显示对过滤能力或产率的显着影响。然而,应避免高驱动力以降低潜在的剪切应力。

纯化PDNA灭菌级过滤的预期性能:

推荐的质粒纯化和各自的性能

问题6.

我们应该做些什么样的测试来评估我们的质粒DNA质量,并以质量如何影响矢量制造

质粒DNA的质量和纯度对于成功转染至关重要。关键观察是苯酚,内毒素和氯化钠。苯酚和内毒素对于细胞可能有害,并且盐可以干扰脂质络合,这导致转染效率降低。

为了确定质量,可以评估(但不限于):

  • DNA浓度(OD 260nm)
  • DNA纯度(OD 260/280 NM或UV扫描)
  • 内毒素(LAL测试)
  • 渗透
  • 残留基因组DNA(琼脂糖凝胶电泳或QPCR)
  • 残留的RNA(琼脂糖凝胶电泳)
  • ph
  • CCC单体含量(HPLC或通过琼脂糖凝胶电泳)

通过我们的Bioreliance测试服务,我们提供广泛的测试,帮助您评估从生物安全检测要求(无菌,内毒素,宿主细胞蛋白质,宿主细胞DNA,测序,质粒构象)到产品表征测试的质粒DNA的质量(具有质谱(MS)的分子量(ID),纯度 - SEC / IEX / RP(取决于PDNA尺寸),浓度 - A260 / 280)

问题7.

我们通过使用苯并酶治疗来除去质粒。这是你建议的还是更好的解决方案?

去除DNA是病毒载体制造的关键挑战之一。为了达到<10ng DNA /剂量和DNA尺寸<200bp的调节要求,需要良好的策略。典型的策略由至少三种不同的技术组成:

  • DNA消化,使用内切核酸酶
  • 切向流过滤,以除去碎片的DNA
  • 色谱纯化

目前,苯并酶®内切核酸酶被视为载体处理中DNA消化的行业标准。它是一种有效的内切核酸酶,可以降解所有形式的RNA和DNA(单次和双链)。一个单位的苯并酶®内切核酸酶能够在30分钟内将大约37μg的DNA降低至低至3-8个碱基对。苯并酶®内切核酸酶以三种不同的质量等级提供,以满足尽可能宽的加工和成本要求。例如最高纯度等级是苯并酶®内切核酸酶安全加为emprove®专家,它是GMP制造和动物来源的自由。因为它是使者的一部分®计划,它由优质的档案备份,这可以通过监管挑战帮助您快速跟踪。

为了优化苯共酶的使用®内切核酸酶,建议进行小型DOE实验。需要检查的三个参数是浓度,孵育时间和温度。可以找到一个DOE设置的示例这里。还优选检查该过程中的步骤使用苯共酶®内切核酸酶是最佳的,例如,在细胞裂解之前,后细胞裂解或澄清单元后。

使用内切核酸酶消化DNA有几个好处:

  • 限制病毒 - 核酸复合物(由于PI和/或保留时间偏移而纯化不可预测),因此增加产率。
  • 保护下游设备免受DNA污垢
  • 减少粘度

苯酶酶的一般信息®可以找到内切核酸酶这里

问题8.

您可以通过您的建议查看质粒DNA纯化的选项吗?

讨论了质粒DNA纯化的不同选择和建议,并在问题5中制定了5.有关PDNA净化的最佳参数的更多信息和数据,您可以参考我们的白皮书关于“质粒可扩展纯化”DNA:疫苗制造的策略和考虑因素“。

问题9.

生产需要多少起始材料?

关于质粒生产,当使用高拷贝数质粒时,具有40-60g / L的细胞密度的优化发酵过程可以实现约1-2g / L的PDNA产量。

对于病毒载体生产,每一个1L生物反应器需要0.5mg的瞬时转染病毒载体(AAV或Lentivirus)的PDNA。1 L转染的生物反应器通常为慢病毒的AAV和3E9病毒基因组产​​生1E14病毒基因组。

问题10.

你什么时候需要投入GMP质粒,什么时候研究成绩好?

为了生产病毒载体,越来越多的FDA法规将很快推荐使用GMP兼容质粒进行临床批次。质粒是一种关键材料属性,因为它可以影响最终产品的安全性和质量。因此,强烈建议在生产临床批次时开始使用GMP柔顺的质粒(从阶段1开始)。此外,一旦监管机构调整调节,将制备一个人。对于过程开发和临床前批次,可以使用研究级质粒。

对于基于Na的疫苗,需要将PDNA直接注射到人体中的癌症疗法或基因疗法,GMP级质粒。

问题11.

我们如何降低我们的病毒载体制造的成本,特别是我们的质粒DNA成本?

几个参数可以影响病毒载体制造的成本,例如细胞系(粘附与悬架)和过程策略(单用多用途解决方案)。数据表明,在选择悬浮培养与粘附培养物时,上游成本可以降低高达57%。一次性解决方案消除了清洁和清洁验证的需求,并允许更高的灵活性和增加的制造能力。

PDNA制造的成本降低,可以通过有效的下游加工和结合单用溶液来实现。在问题5中讨论了在下游处理期间获得高产的产品建议。

问题12.

您是否建议在内部外包或制造质粒DNA?

如今,大多数如果不是所有的PDNA制造都正在外包给专业制造商和CMOS。随着PDNA在生物野蛮行业的需求日益增加,对适当的制造能力和专业知识的需求也在增加。这增加了建立长期解决方案的需要,以便准备好涵盖未来的市场需求,并通过投资Inhouse PDNA制造来确保供应诚信。

外包成本非常高,需要高度专业化的专业知识和制造工厂。与此同时,建立具有所需专业知识和能力的PDNA生产设施也是昂贵的投资。这两种选择都有利弊,并决定在房屋或外包中制造质粒DNA,需要考虑到与公司简短和长期一致的所需专业知识和设施的可用性进行强大的成本评估研究术语愿景。

例如,使用PDNA作为病毒载体生产的原料的公司将具有不同的视觉和需求,与使用PDNA作为疫苗或直接基因转移治疗的最终产品的公司相比具有不同的视觉和需求。换句话说,外包公司的核心活动与外包部分不同。

外包可以从所需的能力和能力中受益,以及质量,效率,生产力和超速时间到市场。但是,重要的是要根据他们对现场,质量管理系统,时间表,时间和成功的监管检验历史上的经验来仔细选择合作伙伴。外包工作是您的业务的延伸,因此找到合适的合作伙伴与您的公司的合适合作伙伴很重要。

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