提高活细胞荧光成像

介绍

活细胞荧光成像提供了研究细胞功能的机会,然而,在不损害细胞健康的情况下成像弱荧光的能力可能存在挑战。

在“专家问答”会议期间,我们将讨论在不损害细胞、光漂白或负面影响细胞健康的情况下成像弱荧光剂所面临的挑战,以及赛默费雪科学公司如何用专门的介质配方解决这一问题,FluoroBrite DMEM™。FluroBrite DMEM是一种基于DMEM的配方,其背景荧光比标准的无酚红DMEM低90%。fluorbrite DMEM的设计目的是增强荧光剂的信噪比,这样研究人员就可以在促进细胞最佳健康的环境中看到即使是最弱的荧光事件。

问题可能包括:

问题可能包括诸如如何提高用培养基与PBS相比的细胞成像,以及如何在同一培养基中既培养细胞又成像细胞。

谁应该参观会议?

  • 你是在尝试用荧光成像法成像一种难以表达的蛋白质吗?
  • 您是否希望提高活细胞成像分析的信噪比?
  • 您的成像分析是否从介质转换到PBS,并丢失宝贵的细胞?
  • 你们在PBS中进行活细胞成像吗?不在培养基中细胞会改变形态?
  • 使用无酚红介质成像时,还能看到高背景荧光吗?

[“问专家”会议由赛默费雪科学公司赞助,维吉尼亚·斯宾塞主持。Spencer博士是一名研发科学家,拥有生物化学和表观遗传学博士学位。她在劳伦斯伯克利国家实验室完成了博士后研究,在活细胞荧光成像方面有丰富的经验。Virginia自2010年以来一直担任ThermoFisher Scientific的研发科学家,目前正在开发提高细胞培养性能和活细胞成像体验的产品。

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问题1

什么是成像椭球体的最好方法?

我建议用共聚焦显微镜在低背景荧光介质(如氟硼酸盐)中成像球状体。如果你想在悬浮液中成像球体,你可以试着在成像载玻片的表面涂上一层基材,比如粘在球体上的聚赖氨酸。如果球嵌在细胞外基质(ECM)中,你可以固定,冷冻保存,冷冻切片,然后免疫标记球。这种方法产生漂亮、清晰的图像,但不提供关于球形三维环境的信息。如果您希望获得嵌入在ECM中的球状体的3D上下文信息,您可以使用PBS-EDTA部分溶解ECM,将球状体连同残留的ECM涂抹到载玻片上,进行固定,然后免疫标记。

问题2

我觉得成像本身对我们的细胞行为有影响并且扭曲了实验结果。你将如何设置一个对照测试来验证?如果是的话,我怎样才能将对细胞行为的影响最小化呢?

这是一个很难回答的问题。荧光成像实验中的实验结果可能会受到暴露在荧光光线下、成像环境或外源荧光标记转基因的非自然表达的影响。为了控制成像对细胞行为的影响,最好是用另一种不需要暴露在荧光灯下或转基因表达的非基于图像的细胞或生化分析来验证成像实验的结果。如果不可能,我建议如下:

1.确保成像环境具有维持良好细胞健康所需的最佳二氧化碳浓度和温度。

2.使用成像细胞培养基,如氟硼酸盐,具有非常低的荧光背景,但所有必要的营养长期细胞健康超过几个小时或几天。低背景介质将减少使用高激光强度的需要,因为高激光强度可以伤害细胞或改变它们的行为。

3.进行滴定实验,将实验系统中的细胞暴露在一定的荧光水平和/或暴露时间下,并在此范围内监测细胞的行为。这仍然不是理想的方法,但至少可以帮助你确定细胞成像所需的最低光照量,从而最大限度地减少对细胞行为的任何负面影响。

问题3

在成像过程中对细胞的一些损伤,即使是很小的损伤,对我们来说也是很常见的。你对成像后的细胞修复有什么建议吗?

细胞培养基暴露在荧光光线下会形成自由基,从而损害细胞。我建议你在荧光成像后立即给你的细胞注入新的培养基。我还建议你尽快把你的细胞转移回CO2 & 37°C的培养箱。为了帮助防止细胞损伤的发生,我建议使用荧光背景较低的氟硼酸盐等细胞培养基。这将减少使用能伤害电池的高强度激光的需要。

问题4

是否有可以避免干扰成像的媒体组件?

干扰成像的主要介质成分是酚红和维生素。酚红猝灭绿色和红色发射通道的荧光,导致荧光剂的信噪比大幅降低。特别是在绿色通道中,维生素会自动发出荧光,这种效果也会降低荧光团的信噪比。

问题5

我正在寻找一种简单的方法来评估细胞存活率使用成像,你可以推荐荧光标记吗?

这里是一些试剂的列表,提供了一个简单的方法来评估你的细胞的生存能力。

1.对于活细胞和死细胞的成像,考虑使用live / dead®细胞成像试剂盒(488/570)(SKU R37601:https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/R37601)

2.对于总细胞(活细胞和死细胞)与死细胞的成像,考虑使用ReadyProbes®细胞活力成像试剂盒,蓝色/绿色(SKU R37609:https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/R37609

3.仅对死亡细胞成像,您可以使用NucGreen®dead 488 ReadyProbes®试剂SKU R37109 For green (https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/R37109)或红色的SKU R37113 (https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/R37113)。

问题6

我们的荧光融合蛋白正在改变表型。我们能挽救这个方法还是应该尝试其他方法?

我建议将你的蛋白质克隆到一个可诱导tet的载体或一个具有较弱启动子的载体,如EF-1 alpha。然后,你可以对表达这种结构的异质细胞群体进行克隆选择,以确定一个表达较低水平的融合蛋白的克隆,这种融合蛋白不会改变你的细胞的表型。如果你在低背景介质中成像你的细胞,比如氟brite DMEM,你可以试着降低光源的强度,以减少由于你的融合蛋白过度兴奋而造成的细胞损伤。如果这两种方法都不起作用,可以考虑用另一种不需要暴露在荧光灯下或转基因表达的非基于图像的细胞或生化试验来验证你的成像实验结果。

问题7

使用氟氟化物介质有什么特殊考虑吗?其他的媒体变化,等等。

氟brite介质就像普通的二氧化碳缓冲DMEM介质一样工作。只需加入与常规DMEM相同浓度的FBS和/或任何其他补充剂,并在5% CO2、37℃和潮湿的环境中对细胞进行成像。

问题8

您希望哪种血管能获得良好的成像结果?

对于高(甚至低)分辨率的活细胞图像,我更喜欢使用腔室盖或带玻璃底部插入的35mm培养皿。玻璃套套或插页的厚度取决于你想要达到的图像质量,然而,在大多数情况下,1.5号玻璃套套/插页应该可以工作。

问题9

成像后,我们的细胞立即恢复正常,12小时后,健康状况似乎会迅速恶化。想法吗?

如果不了解更多关于成像设置的细节,很难回答这个问题。我假设你是在CO2缓冲细胞培养基中对细胞进行成像,环境是37摄氏度,5% CO2,加湿。细胞健康状况的逐渐下降表明可能发生下列情况之一:

1.媒体蒸发

在显像室的某处放置一个装有无菌蒸馏水的容器应该有助于介质蒸发。如果你是在一个多孔容器中成像,我建议也在包含培养物的容器周围的所有空孔中放置无菌水/PBS。

2.由于低二氧化碳水平,介质缓冲不足

你正在使用的系统可能不能为培养细胞提供足够的二氧化碳来维持长期的细胞健康。为了测试这一点,我建议将你的成像培养物放置在含有酚红的培养基中,随着时间的推移,视觉上监测培养基的颜色。如果介质的颜色从红橙色变为红紫色,则表明可能存在较差的二氧化碳气体交换。

3.光毒性的光暴露

有些细胞比其他细胞对光线更敏感。随着时间的推移,你的细胞可能会随着反复的光照而逐渐受损。如果是这样的话,我建议你用含氟DMEM或其他低背景荧光的介质成像你的细胞。使用低背景介质的好处是,您可以在不影响荧光团的信噪比的情况下降低潜在破坏性荧光的强度。另一个建议是,在你看到健康状况开始恶化之前,给你的细胞提供新鲜的培养基。这是因为荧光会在细胞培养基中形成对细胞有害的自由基。

4.因荧光标记蛋白过表达而引起的毒性

荧光标记蛋白的过表达有时会引起光毒性。你可以考虑将你的蛋白质克隆到一个可诱导tet的载体或一个具有较弱启动子的载体,如EF-1 α。然后,你可以对表达这种结构的异质细胞群体进行克隆选择,以确定一个表达较低水平的融合蛋白的克隆,这种融合蛋白不会改变你的细胞的表型。

我们在ThermoFisher科学公司拥有一支由知识渊博的技术服务代表组成的优秀团队。如果上面提到的方法都不能解决您当前的问题,我建议您向技术服务部门寻求进一步的指导。

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