最小化压力对多能干细胞健康的影响在一系列工作流程中

多能干细胞(PSCs)是基础研究的基础工具,以及再生医学、基因治疗、药物发现和毒理学评估等应用。而干细胞已被证明有巨大的增殖能力,强调细胞长期文化已被证明导致突变的积累导致遗传不稳定,增加细胞的致瘤性,从而限制了他们的效用的研究和临床应用。在标准培养过程中,PSCs在低温保存、解冻后恢复和传代过程中都经历了显著的细胞应激。下游过程,如基因编辑,应用额外的细胞应激,包括细胞活力和进一步的PSCs遗传稳定性。因此,在这些工作流程中尽量减少细胞应力影响的解决方案是确保电池供应的可靠性和一致性以及实验再现性的必要组成部分。

冷冻保存诱导的细胞损伤机制

冷冻保存解决方案提供了电池供应的实验灵活性和一致性,允许生成早期通道PSC的银行。然而,由于冷冻保存过程的细胞损伤可以显着影响解冻后恢复,并且在某些情况下导致细胞系丢失。在冷冻保存过程中,细胞损伤通过细胞内和细胞外冰形成,脱水和细胞内的溶质浓度的增加。为了有助于减轻这种细胞应激,慢速冷却方法,其中细胞以〜-1℃/分钟的速率冷却至-80℃,随后将其转移到LN2杜瓦尔。这些慢速冷却方法允许从细胞的细胞溶胶中逐渐排出水,从而减少细胞内冰形成的可能性,缓慢改变细胞内的溶质的浓度。另外,使用冷冻保护剂如DMSO,丙二醇或乙二醇,以降低冷冻温度,从而减少细胞内和细胞外冰的形成。冷冻保护剂另外渗透细胞以允许更换细胞内的水,帮助最小化细胞收缩的影响和在细胞内溶质浓度的波动。

当低温保护剂被用来帮助在低温保存过程中减少细胞的压力时,它们也对细胞有毒。这种毒性依赖于时间和温度,浓度和温度越高,对细胞的毒性惩罚就越大。此外,在从细胞中去除冷冻保护剂的过程中,细胞体积的突然变化会通过渗透冲击导致细胞膜破裂,从而立即损害细胞的活力。由于这种保护和毒性的平衡,虽然不同溶液中低温保存的PSCs直接解冻后的活力通常是高的数倍,但在最初24小时内,由于上述细胞应激的叠加效应,显著的凋亡和坏死发生。因此,解决方案和程序是非常重要的,以实现最佳的PSCs解冻后恢复。

减轻细胞应激的影响已经被恢复期间,小分子如y - 27632或thiazovivin历来被添加到培养基第一24小时post-thaw抑制ρ激酶相关卷曲螺旋蛋白质,从而抑制肌动蛋白细胞骨架重排,最终已经被阻止细胞凋亡。然而,除了抑制ROCK活化外,Y-27632和噻唑vivin还抑制了一些其他蛋白激酶,影响了一些脱靶通路(图1)。此外,这些小分子不会在冷冻保存和回收过程的过程中解决在细胞中变得丰富的反应性氧物质的形成。改进的解决方案是在解冻后的前24小时内优化细胞活力,以及提供更多选择性小分子,以最小化潜在的偏离目标效果的影响。

图1:

RevitaCell™补充物中prosurvival小分子的SelectScreen®激酶分析显示,与传统的ROCK抑制剂相比,它具有更大的选择性
图。1。选择Revitacell™补充剂中的刺激小分子的SelectScreen®激酶分析表明,与传统岩石抑制剂相比,它具有更多的选择性。对319个激酶的面板进行测试小分子化合物。显示了表现出大于80%抑制的激酶。

引进Thermo Fisher Scientific的PSC低温保存试剂盒,有效降低低温保存过程中应激的影响

Thermo Fisher Scientific’s PSC Cryopreservation Kit (Cat #A26446-01) contains a ready-to-use, xeno-free PSC Cryomedium coupled with an animal-origin-free, chemically-defined recovery supplement−RevitaCell™ Supplement (Cat #A26445-01). When used together, these solutions provide optimum cryopreservation and recovery of PSCs, minimizing loss of cell viability and thus maximizing post-thaw recovery. Some of the key features of this system include:

  • 高效恢复-解冻24小时后,通常比使用同类最好的竞争性低温保存溶液,然后在补充Y-27632的生长培养基中恢复时,可获得50%的多活细胞(图2)。

图2

解冻后24小时恢复后,50%以上的存活细胞恢复。
图2所示。解冻后24小时恢复后,50%以上的存活细胞恢复。PSCs在PSC crymedium或商业上最好的竞争对手溶液中低温保存,然后分别使用补充了1X RevitaCell™Supplement的必要8®培养基或10µM Y-27632进行恢复。解冻24小时后,使用TrypLE™选择收集细胞,通过台虫蓝排斥进行活细胞计数。
  • 一致优化的解决方案和cGMP制造工艺提供了最佳质量的低温保存和恢复解决方案。
  • 易于使用 - PSC冷冻保存套件作为即用待使用的组件提供,可节省宝贵的时间。
  • 多功能 - PSC冷冻保存试剂盒与在各种媒体系统中培养的Clump和单细胞传代的PSC兼容,包括基本8®,Stempro HESC SFM和其他商业上可用的配方。
  • Revitacell™补充剂含有更具特异性的岩石抑制剂,其与抗氧化剂和自由基清除剂相结合,抑制形成并保护细胞免受ROS累积。
  • 此外,可以用于冷冻保存和恢复人外周血单核细胞,提供无象鼻替代的冷冻保存。

RevitaCell™补充的额外效用,在与单个细胞传代相关的压力中支持细胞

尽管无饲料培养系统的出现极大地提高了PSCs的可扩展性,但使用簇传代技术(如使用试剂如disase、胶原酶或EDTA)经常与下游实验应用不兼容,如高通量筛选、基因编辑和定向分化。

单细胞培养是干细胞培养研究的某些领域的标准化和可接受的实践。通过使用使用单细胞解离技术的技术,科学家能够具有可靠的细胞用于下游应用和克隆选择,成像,细胞分选等的比较的基础,其中细胞回收和细胞数对成功至关重要。Revitacell™补充在使用必需8™培养基(图3.)。

图3.

Revitacell™补充剂在使用TryPle™选择酶的单细胞传代中显示了效用。
图3所示。Revitacell™补充剂在使用TryPle™选择酶的单细胞传代中显示了效用。使用Cortple TM选择酶使用蜕皮载体产生的IPSCs,并在25,000个活细胞/ cm2的密度上播种,在涂有截短的重组人Vitronectin的培养板中,具有1x Revitacell TM补充剂。在24小时恢复期之后,IPSCS在尤文中单独使用必需的8次媒体,以便他们在文化中的其余时间。

更多信息,帮助您选择正确的低温培养基为您的研究,和这些产品的应用说明,请访问以下链接:

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