需要治疗基因编辑,以开发下一代汽车T治疗

两种嵌合抗原受体(汽车)T细胞疗法(Kymriah®和yescarta®)由美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药物局(EMA)批准,以治疗儿童和年轻成人的B细胞急性淋巴细胞白血病,分别在成人中弥漫大B细胞淋巴瘤。两种疗法导致临床试验期间高目标响应率(约80%的治疗患者)(Neelapu,2017)(O'Leary,2018)。尽管存在这些批准,但问题仍然是Cell-T-Cell等细胞疗法,代表前线疗法的新时代,以匹配单克隆抗体的潜在意义,或者是否将是狭窄范围的有效但利基的方法适应症和相对少量的患者。这主要是由于当治疗固体患者而不是液体肿瘤时所遇到的挑战。如果他们在臭名昭着的免疫抑制实体肿瘤微环境中具有疗效,汽车T细胞可能需要通过基因工程来提高游戏。

从批准的汽车到普遍汽车

目前,使用患者自己的T细胞构建CAR-T疗法,其中在从患者移除的情况下,将T细胞扩展并用汽车延伸,该轿厢在肿瘤细胞表面上结合特定蛋白质。因此,当浸入患者时,汽车可以募集T细胞到肿瘤细胞,并使其与该细胞接合。接合向汽车T细胞发送信号以攻击附着的细胞,导致肿瘤细胞的死亡。在该范例中,汽车几乎作为治疗效应组分的靶向系统,这是T细胞。

产生上述轿厢T细胞并用于产生Kymriah和Yescarta的过程称为自体细胞疗法。这个过程需要时间,已经证明了过程控制的问题,是这些疗法高治疗价格的主要贡献者之一。“静脉到静脉”时间治疗这些疗法的患者是2-3周,由几个不同的步骤组成,导致复杂的制造和供应链。事实上,到2019年底,诺华未通过制造失败或出于规格问题,未来10%的时间。因此,许多公司正在试图制定同种异体或通用疗法,从而用于制造一系列汽车T细胞的群,以治疗多个患者的过程中的多种患者更类似于传统的生物制剂制造。然而,为了开发同种异体疗法,需要改造对T细胞的相当大的改变。

迄今为止,对Car-T细胞的功效的显着改善来自改变汽车的设计,使得T细胞的激活得到改善。然而,除了汽车的表达之外,电流批准的汽车T细胞主要被未修饰,T细胞基本上处于其自然状态。例如,改变T细胞可以通过降低其耗尽能力来改善其对靶向癌细胞的能力。此外,为了能够实现实体肿瘤的靶向,因此超出了由Kymriah和Yescarta的批准适应症服务的相对小的患者人口,需要克服许多自然障碍。例如,肿瘤分泌的许多细胞因子抑制肿瘤微环境的贩运和免疫抑制性质意味着如果它们到达肿瘤周边,则T细胞能够对肿瘤细胞发挥其细胞毒性作用。对于同种异体的CAR T细胞,存在额外的挑战,因为这些细胞可以被患者的免疫系统视为外国,并在递送后不久杀死。同种异体Car-T细胞也造成触发移植物与宿主疾病(GVHD)的风险,其中植入的T细胞将患者组织视为外国和攻击它们以及肿瘤细胞。因此,必须改变同种异体的汽车T细胞,使得它们保持足够长的时间以有效并且不会诱导GVHD。

显而易见的是,通过改变T细胞的底层生物学,可以改善汽车T细胞疗法的几种不同的方式,使它们与内部或细胞内刺激不同。因此,通常通过靶基因的差异调节介导的反应,用于改变特异性基因以获得所需表型的方法是细胞疗法内的研究的关键研究。

工程下一代汽车

只有最近,基因组工程技术已经进展到可以想象在治疗环境中使用这些技术的程度。众所周知的方法,如锌手指核酸酶(ZFN),转录活化剂如效应核酸酶(TALENS)和聚类定期间隙的短语重复(CISRPR)-CAS,使用类似的作用机制来工程到基因组。最常见的工程事件类型是基因的淘汰赛,主要是因为从技术角度来看,这是修饰基因组的最简单和最有效的方法。为了改变基因,使其不能再产生mRNA和从该蛋白质中产生传统的编辑技术,靶向特定的DNA序列并使用核酸酶切割DNA并产生双链断裂(DSB)。在哺乳动物细胞中,这些断裂主要是使用非同源终端连接(NHEJ)的修复,其固有的DNA修复机制。通常,碱基将从断裂点添加或切除,导致在重新加入破损的末端时产生插入或删除('indels')。如果这些诱导改变基因的读数框架(框架突变),这通常会导致非致盲mRNA,从而导致靶基因的功能敲除。如果目标正确,ZFN,Talens和Cark-CAS编辑技术具有高的编辑效率。这些方法正在用于改善汽车疗法,因此为什么有更多的基因工程轿车疗法可用?

这是一个原因是时间。虽然发电的汽车T细胞并不简单,但批准的第一个汽车T治疗总是可能的基础编辑技术上是最简单的。如上所述,即使干预率相对较少,这种治疗的制造也远未简单。因此,可以理解的策略是改进这些现有的疗法,例如通过工程到异构平台而不是使用在Kymriah和Yescarta中存在的相同有效的汽车设计的自动研究。实际上,几种这样的同种异体Car T细胞已经进入了包括基因组工程步骤的临床试验。然而,这些汽车T细胞没有超过3个基因修饰,并且可以估计高达10种遗传变化,以产生稳健,有效和安全的同种异体的汽车T细胞以治疗实体瘤。那么为什么轿车T细胞具有较高数量的改变基因未进入临床试验?

由于基因组工程,这是患者安全问题的主要原因。这些安全问题可以分为两个主要类别。第一个是脱靶效果。ZFN,Talens和Crisp-Cass工程平台必须与DNA中的特定序列结合以改变感兴趣的基因。但是,基因组中通常存在其他序列,其与靶序列高度相似,并且误差的核酸酶结合。在这种情况下,可以将额外的基因淘汰,这些基因可能对患者具有有害后果。一个明显的例子是敲掉的基因是肿瘤抑制基因 - 这可能导致患者注入潜在的癌细胞,如果该T细胞在成功治疗的患者中存活过长期,那么患者可以继续发展由工程化T细胞驱动的T白血病。目前,使用硅基和基于实验室技术的组合的潜在脱靶淘汰一代的详尽分析,目前减轻了偏离目标效应的风险。如果发现任何偏离靶点,则需要重新设计工程试剂,或进行风险评估,以分析敲除鉴定的脱靶基因的后果。 This could be done by generating cell models containing deliberate knockouts in those genes to analyze the phenotype generated. However, where multiple off-target loci are identified, the consequence of knocking out different combinations of the genes needs to be assessed as this can be very different to the impact of knocking out genes in isolation. Importantly, there is currently no agreed industry standard for identifying off-target effects and there remain difficulties in establishing comprehensively where any off-target binding occurs.

第二安全涉及围绕本技术效率固有的DNA DSB的产生。如果DNA在多个地方被打破,通过在几个基因中引入多种基因,NHEJ修复途径可以不正确地重新加入松散的末端,导致染色体易位。虽然可能性是基因组中的这种像差会导致细胞的死亡,但这些易位可能赋予T细胞的增殖或生存优势之一存在风险,可能导致促癌细胞。冲击易位预测比简单基因敲除更难预测,因为它受到突破两侧的精确吲哚的影响,这是否产生具有癌症的功能性杂交蛋白导致效果。这种改变难以模拟使用体外作为复制精确易位的技术在技术上具有挑战性。这些易位的不可预测性意味着甚至瞄准两个基因可能导致意外后果,即使只有四种可能的易处形(假设没有偏离目标事件)以尝试建模。如果假设需要同时靶向多种基因以显着提高同种异体汽车T细胞的功效,则可能的易位的预测变得令人指重。例如,如果一个人只瞄准3个基因并假设每个工程事件的2个潜在的脱靶站点,这将需要映射768不同的易位进行建模,并且这不是允许在每个indel形成后产生的不同帧的影响!!(见图1)。

基于编辑
图1。

值得注意的是,不同的技术具有不同的离心率结合率,并且由于传统基因工程技术引起的偏离目标编辑的重要性是关注的基于细胞的治疗方法的开发人员,业界总是希望改善这些技术。听到6-10次敲除需要讨论的讨论并不罕见,以实现提高汽车T细胞的疗效所需的工程复杂性,使得它们可以更有效地冲击固体肿瘤。如果这是在一步完成的,则会有效地评估偏移目标效果变得不可行,因此问题随后是如何在没有相关的非目标风险的情况下生成这种工程级别。

解决多种遗传编辑的挑战

实现这一目标的最简单方法之一是执行多轮工程,从而最大限度地减少同时发生的断裂次数。然而,这在产生工程细胞的时间围绕产生了明显的影响,并且可能与自体疗法不相容,其中患有迅速推进的癌症的患者没有几周才能等待有效的治疗。同种异体疗法,特别是使用克隆衍生的细胞系(例如诱导的多能干细胞(IPSC)的细胞系(IPSC)的同种疗法可能更符合这种方法,但显影时间仍然至关重要。同样,即使只有少数工程步骤,偏离目标事件的负担和对潜在易位的后果也不会被驳回。也许更令人满意的解决方案是使用一种通过最小化DSB的产生和脱靶基因编辑的影响来减轻患者风险的技术。

最近受到重大关注的一种这样的技术是基本编辑。该技术通过使用脱氨酶酶来执行转化突变的转变突变,该转变突变将一个碱基转化为另一个特定基础,并且不依赖于引入DNA双链断裂。通常存在胞嘧啶的脱氨酶,其将胞嘧啶转化为胸腺嘧啶,并且最近也开发了一种合成的腺苷脱氨酶,其将腺苷转化为鸟嘌呤。基础编辑的初始治疗焦点之一是基因疗法的工具,过渡突变被认为能够解决弥补许多人类致病性突变的疾病引起点突变的60%。然而,在修饰T细胞的上下文中成为有效的汽车T细胞,同样重要的是使用基础编辑产生止芯密码子的能力,防止基因转录,从而敲出基因。

基础编辑目前基础编辑系统通过使用指导RNA和改性的CA蛋白,即刻录DNA而不是产生DSB。引导RNA将CAS带到特定的基因组位置和通过各种方法,该平台也可以通过脱氨酶与CAS蛋白或引导RNA的相互作用来引入脱氨酶。脱氨酶以及由CAS蛋白激活的宿主细胞DNA修复机制的特定部分转化为DNA,在这种情况下转化靶碱,在这种情况下CGA密码子的C为T产生TGA,止挡密码子。

当然,这项技术的关键是没有作为基因改性机制的一部分引入DSB,因此这种技术应该具有由于引入DNA DSB而产生的显着降低的偏移效果。缺乏DSB意味着indel生成的水平非常低,因此易位的风险比例地减少。然而,基础编辑不利用偏离目标效应,除了靶向基因之外,介导的偏离目标编辑的介导的偏离目标编辑可以导致DNA中的转变突变。额外用基础编辑考虑的额外安全系数是导液-RNA无关的脱靶脱胺的可能性,其中脱氨酶靶向整个基因组碱基。目前正在调查这种可能性并修饰达氨酶以限制这种能力是排序的。

Yescarta和Kymriah的批准治疗B细胞肿瘤的患者在尝试使用免疫系统治疗癌症的历史中是一个巨大的事件。一些公司正在寻求拓宽汽车方法中使用的免疫细胞,并包括但不限于汽车NK细胞和汽车B细胞。与汽车T细胞相比,这些细胞具有不同的能力,但所有这些细胞都需要一定程度的基因编辑在临床中有效使用。哪种形式的基因工程将成为未来几年的免疫细胞疗法的前跑步者目前是辩论的。然而,正如本文中所讨论的,基本编辑可以是实现多种遗传改变的路线,同时避免对基因组潜在有害的结构改变。随着更多实验室使用基础编辑器来修改细胞表型,我们将更好地比较数据集,并批判性地看起来标准基因编辑平台和基本编辑平台的优势和缺点。

要了解更多信息,请访问:https://horizo​​ndiscovery.com/en/gene-editing/baseititing.

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