治疗性寡核苷酸的优化表征和定量

寡核苷酸(Oligonucleotides, OGN)是一类由合成核苷酸短链组成的治疗药物。ogn有能力改变、抑制或恢复与疾病或健康相关的靶基因的表达。这使得它们在治疗已知遗传成分的疾病方面处于独特地位。目前有超过80家公司正在研究ogn治疗疾病,它是一种快速增长的治疗方式。

第一个OGN疗法,Vitravene,也被称为Fomivirsen,于1998年获得批准。自那以后,ogn的应用不断发展,随后又获得了几项批准。与大多数新兴疗法一样,在制造方面也存在挑战,特别是对ogn进行表征和定量可能非常困难。我最近观看了SCIEX全球技术营销经理Sean McCarthy博士的网络研讨会,该研讨会全面解释了ogn当前的分析挑战,以及改进其表征和定量的工具和技术。

McCarthy博士首先介绍了ogn的背景,并回顾了当前的分析挑战,包括负离子模式、离子配对剂的使用、加合离子的形成、宽电荷态分布、依赖于电荷态选择的碎片效率以及样品制备回收率。

然后他讨论了SCIEX为OGN分析提供的仪器。他从QTRAP®6500+ LC-MS/MS系统、TripleTOF®6600+ LC-MS/MS系统和X500B QTOF质谱平台开始。所有仪器在负离子模式下性能良好,这是OGN分析所需要的。然后他讨论了他们的分离工具,包括高流量和微流量的选择。对于微流,microflow M5 Micro LC提供了有效的分离和非常好的灵敏度。Sean接着谈到了在仪器前端耦合OptiFlow™接口,这使得他们可以在微流过程中获得非常好的灵敏度,而无需设置微流仪器的挑战。OptiFlow®离子源不需要改变或调整,以实现最佳性能。最后,SCIEX拥有高质量的定量软件,并与Novatia合作使用ProMass软件进行定量工作和表征。

OGN表征

Sean接着解释了LC-MS可以为表征提供什么:

  • 大量确认目标序列
  • MS/MS序列的确认——需要确保在合成过程中碱基的顺序是符合预期的,并且用于合成的试剂被放置在正确的位置。
  • 纯洁的评估
  • 故障识别序列

可用于帮助表征的特定组件包括:IonDriveTM系统技术和Turbo V™离子源,提供分子的高效脱溶剂。这是重要的,如果使用高或中等浓度的离子配对试剂实现色谱分离。QJet®离子向导将离子转移到质量分析仪,同时减少前端的污染。它提供了有效的离子配对试剂的去除,甚至是强大的复杂矩阵。

接下来,Sean介绍了特定的特性数据示例。他在质谱和质谱/质谱水平上证明了目标序列的大规模确认。数据显示了一致的性能和不同的电荷状态存在。数据还显示了不同物种的强大信号(图1)。

图1

接下来,他展示了用于OGN治疗测序的高质量MS/MS数据示例。在数据中,您可以看到贯穿整个OGN的健壮片段离子数据,其中有来自两个不同离子系列的代表性片段(图2)。

图2

另外还提供了更详细的离子数据。

Sean随后展示了使用ProMass集成的LC-MS故障序列识别和杂质识别的数据。他给出了界面的概述(图3)。在界面中,您可以看到导入文件的机会,以考虑在ProMass中,然后选择集成参数和选择特定的数据,让ProMass处理。这些原始数据然后由ProMass软件自动处理,生成一个HTML摘要报告,其中包括原始的MS数据和重构的MS数据。

图3

OGN的质谱定量

Sean首先讨论了LC-MS的优点和局限性。优点包括:高选择性,宽线性动态范围和多路复用能力。其局限性包括:与传统结合分析方法相比灵敏度低,试剂成本高。很明显,需要用LC-MS来提高灵敏度。

为了做到这一点,SCIEX研究小组将LC-MS分析方法的总体灵敏度作为流量的函数(图4)。他们发现,当流量在10 μL/分钟到200 μL/分钟之间时,灵敏度没有太大的变化。然而,当微流量范围为1-10 μL /min时,灵敏度显著增加,而当纳流量范围为100-1000 nL/min时,灵敏度又显著增加。

图4

该团队专注于优化微流,因为它在提高灵敏度和提供良好的流量之间提供了良好的平衡。

在这项工作中,他们使用了带有OptiFlow®离子源的M5 MicroLC。OptiFlow®离子源提供了一个即插即用的解决方案,在源上有最小的柱和电极配件,分散最小。此外,不需要源优化,因为源几何都是预先优化的。OptiFlow®离子源还具有优异的流动喷雾稳定性,这意味着良好的重现性和运行性能。

接下来,Sean介绍了使用微流LC/MS进行Fomivirsen定量的案例研究。

它是一种具有全磷硫键的反义OGN 21-mer。比较了300 μL /min的高流量和6 μL /min的微流量。他们发现这些参数实际上是相同的(图5)。

图5

接下来,他们观察了两种流速之间的定量结果。对于常规流量,在300 μL /min下,他们的校准范围为2 - 1,000 ng/ml(图6)。

图6

微流量校正范围为.05-1,000 ng/mL,线性范围为6 μL /min。他们获得了非常好的信噪比(图7)。

图7

接下来,他们比较了两种流速的敏感性。使用微流,他们能够将信噪比提高10倍(图8)。

图8

这项研究的关键结论是,微流将流速降低了50倍。采用μLC/MS,离子配对试剂的引入也减少了50倍,从而显著降低了污染的可能性。他们能够量化OGN治疗到pg/ml水平(500 pg/ml)。最后,与高流量LC-MS相比,他们实现了显著的灵敏度提高(5-10倍),线性动态范围达到3.5个数量级。

想要了解更多关于这个实验的信息,请参见网络研讨会:治疗性寡核苷酸的表征和定量

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