质谱分析优化蛋白表达和纯化

在本播客中,我们与Peak protein的专家进行了一场小组讨论,讨论了常见的蛋白质挑战,以及使用质谱技术解决表达和纯化问题。我们还讨论了质谱如何也可以用于复杂蛋白质和过程中修饰的工作。

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我通过询问使用峰值蛋白质服务的组织类型来开始播客。Abbot博士解释说,这些是参与发现新药物的公司和组织,包括生物学,疫苗和小分子。

然后我问他是否可以描述他们正在做的那种工作以及如何通过发现项目帮助他们的客户。他说,他们使用纯化的工程重组蛋白作为研究试剂,以支持使用X射线晶体学的药物筛选和结构生物学。许多筛选努力依赖于专门设计的蛋白质来支持筛选筛选筛选几百万化合物的高通量筛选或采用生物物理方法,例如表面等离子体的共振较少的化合物。对于药用化学家,能够根据现有分子相互作用的详细知识来设计药物。峰值蛋白使用高度纯化的蛋白质的X射线晶体学产生该信息

接下来我问Abbot博士,他们遇到的最常见的蛋白质挑战是什么。他解释说,因为蛋白质是单独的分子,所以制造和纯化的方式必须是蛋白质的个体化。他们每年都会看到膜蛋白,蛋白质复合物,柔性酶,稳定细胞因子等多样化蛋白质。他们首先思考如何最好地设计它,一旦净化如何表征它。这需要不同方法的巨大工具箱。工程蛋白质使其更稳定,可溶于和适当的是至关重要的。挑战包括表达不良的蛋白质,对蛋白酶具有身体不稳定或敏感,蛋白质折叠的速率。标记指出,细胞主持人以及它是如何只培养的一部分过程。考虑蛋白质的设计以及如何纯化是非常重要的。一旦净化,也要考虑如何表征。

接下来,我问他们是否可以描述他们用来表达蛋白质的细胞培养系统以及它们是如何被使用的。Elvin先生介绍了几种用于蛋白质生产的表达系统,包括哺乳动物、昆虫、细菌、植物、酵母和无细胞表达系统。Peak蛋白质公司使用三种不同的系统来表达客户要求的各种蛋白质。这是一个短暂的HEK293哺乳动物悬浮表达系统,一个杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统和各种E.coli.表达宿主菌株。每个系统都有其独特的优点和缺点。

He went on to say that it’s very important to choose the right system for your protein to be expressed in. If the target is a “simple” protein which doesn’t require much post translational modification then it would be better to go for expression in anE.coli.基于系统。这将具有更便宜的主要优点,因为生长培养基通常便宜,并且通常可以在房子里进行。在峰值蛋白质,它们经常使用基于T7的表达载体系统来最大化可溶性表达,并且还可以从中重新折叠蛋白质E.coli.如果需要,衍生的包容机构。

如果蛋白质更复杂,那么您将在HEK293或CHO细胞等哺乳动物系统中产生它们。在这些系统中,蛋白质折叠是更有效的且蛋白质分泌到周围的生长介质中是良好的,使净化过程更加简单,特别是如果与亲和标签和溶解度标签一起使用。使用哺乳动物细胞表达感兴趣蛋白质的主要原因是由于能够在蛋白质上形成的复杂后翻译修饰。然而,细胞培养基的成本通常更昂贵,并且依赖于CO2气体培养器来培养这些类型的细胞系。在Peak Proteins项目中,他们在用含有目标基因的质粒转染细胞后,评估了瞬时HEK293悬浮系统中蛋白质的表达,这可以被放大到一个合理的水平。它们通常与分泌的和细胞内的蛋白质以及许多难以表达的蛋白质一起工作。

他继续研究昆虫细胞表达系统,以及它们现在如何变得越来越受欢迎。Peak Proteins公司使用一种flashBAC杆状病毒昆虫细胞系统来表达分泌的、细胞内的和膜蛋白。这种基于杆状病毒的表达系统再次提供了优点,如正确的翻译后修饰,但不像哺乳动物系统那样复杂,和可扩展性。然而,像哺乳动物系统,生长介质的成本相对于细菌表达系统更高。

接下来,我问他们质谱是如何帮助他们克服表达如此多不同的蛋白质的挑战的。罗林森女士描述了如何将Sciex Exion LC与X500B质谱结合是提供快速结果的理想系统,以帮助应对蛋白质表达的挑战。该系统在完整质量和肽映射分析之间无缝切换。完整质量分析(LC-MS)通过C4柱进行,运行时间通常只有5分钟。肽图谱(lc - mms)使用C18色谱柱,运行时间约为10分钟。两种技术都采用反相LC,色谱柱根据所选择的LC方法经常在两者之间切换。

她说它使他们能够完全努力解决他们拥有的,或者没有以一种单独的方式制造的方式。它更明确。它主要是一个“过程”检查,这些检查会影响他们在表达系统上进行的决定,它们如何使用它们以及它们如何净化蛋白质。

我通过询问有一些关于LC-MS的特定工作领域,如果他们面板可以共享他们在每个领域的使用方式。

蛋白质的特性

Mark描述了分泌蛋白最常见的翻译后修饰之一是糖基化。在分泌的蛋白质上有两种主要的糖基化形式,天门冬酰胺残基的n -糖基化和酪氨酸残基的o -糖基化。然后他解释了为什么糖基化是x射线晶体学的一个真正问题,以及质谱如何提供更多的细节,这为更好地理解糖基化提供了机会。然后,他举例说明了他们如何利用质谱技术成功地使蛋白质结晶,并说有很多例子可以说明质谱技术如何使他们更好地理解蛋白质糖基化。

故障排除难以净化

Mark提供了一个蛋白质重折叠的例子,关于二硫键异二聚体蛋白表达E.coli.包涵体。他说,两个单独的链都分别变性,然后在他们认为可以使正确的二硫键重新折叠的条件下重新折叠。一旦重新折叠,蛋白质用层析纯化,然后在还原和非还原凝胶上进行分析。他们发现在非还原凝胶上,考马斯氏染色凝胶上有两条条带,而在还原凝胶上,考马斯氏还原凝胶只有一条条带。他们认为造成这种差异的原因是有两种物质存在,二硫键在重折叠过程中被搅乱了。这个问题如果不使用质谱法是无法确定的。

进程内的修改

Next Mark提供了几个使用质谱技术进行过程评估的例子。在一个例子中,它被用来识别污染物带通过肽图谱。在另一个例子中,它被用来确定当有30-40个其他蛋白存在时,兴趣蛋白是否存在。他解释说,在某些情况下,少量的蛋白质就足够了,并且可以通过多种色谱步骤来纯化。然而,在这项工作完成之前,了解蛋白质确实存在是很重要的。

使用复杂的蛋白质

标记说明他们经常与膜蛋白一起使用,这些蛋白质是最复杂的蛋白质之一,它们是非常不稳定的。结果,它们很难表达。LC-MS非常重要,因为它允许它们清楚地识别是否存在膜蛋白存在。它们使用LC-MS / MS和肽映射来识别Coomassie染色带确实是膜蛋白。

他们也工作与多蛋白复合物和LC-MS是至关重要的确定所有成分,任何修饰,和整个复合物的质量。

然后我分享了我最近报道的一个Janssen在使用SCIEX的Qtrap LC-MS系统上的演示文稿分析CHO细胞中的媒体代谢物,并通过这种方法获得的信息。我询问他们是否已经使用了大规模规范来改善其文化的生长或生产力或进行过程优化。Elvin先生分享,在峰值蛋白质中,它们尚未使用群众规范,以改善其哺乳动物或昆虫细胞系的生长或生产力,或者确实用于过程优化。

然而,对代谢组的深入了解确实可以为“细胞状态”或“细胞健康”提供强有力的指示,这可以提供关于决定、调节或限制细胞特定功能(如细胞生长和/或重组蛋白生产)的分子事件的信息。

历史上,基于ms的代谢组学方法被用于提高哺乳动物细胞的生物处理能力,这些数据集随后被用于合理化设计和改进化学定义的培养基,优化细胞系特定的喂养制度,以提高生产力和提高产品质量。定义高生产力的代谢标志物,最近定义特定细胞系工程的目标。所有这些都允许哺乳动物细胞,尤其是CHO细胞,产生越来越多的重组蛋白到每升克的范围而不是微克或毫克的范围。

然而,我们对表达各种重组杆状病毒的昆虫细胞系的代谢组学知之甚少,但希望随着越来越多的代谢组学研究的开展,我们将在不久的将来看到该系统生物处理能力的提高。这是我在Peak蛋白质公司非常感兴趣的后续工作,以提高我们自己的昆虫细胞表达系统的生物处理能力。

接下来我问他们何时以及如何使用LC-MS来改变培养条件。阿博特博士分享了另一个他们如何使用LC-MS处理主要不溶性重组蛋白的例子。他们可以用LC-MS鉴定出条带的一部分为不可溶部分,亲和层析后他们不能看到任何有意义的蛋白质。这明确地告诉他们,继续在细胞系中构建这种结构是不可能的。他们决定将细胞宿主转化为杆状病毒。

在另一个以不溶蛋白为主的例子中,他们能够纯化出足够多的蛋白质,用LC-MS鉴定出这就是目标蛋白。因为他们知道蛋白质的存在,他们能够降低温度大肠杆菌改善蛋白质溶解度的方法。

最后,他们利用LC-MS鉴定了昆虫细胞系中产生的蛋白质水解敏感蛋白的收获时间。通常收获会在48小时后发生,但他们发现在36小时后,蛋白质的水解量要少得多。

接下来,我问LC-MS系统是如何适应他们的流程工作流的,以及系统是如何实现的。阿博特博士解释说,他们在整个过程中都在使用它;从第一列检查他们已经纯化了什么,到最后检查交付的产品。正如前面所提到的,他重申,帮助查明问题和决定前进的最佳方式特别有用。该系统的实现很容易,每个人在实验室运行自己的完整质量样本和肽映射LC-MS/MS。

面试结束时,我问他们对那些考虑在实验室中添加LC-MS系统的公司有什么建议。艾博特博士说,LC-MS已经帮助他们排除故障,解决问题,并对每年要处理的数百种蛋白质进行最终QC。他说,许多人认为LC-MS只是一个QC工具,但他们认为它的意义远不止于此。他认为这是一个非常宝贵的工具在任何蛋白质生物化学或蛋白质生物结构生物实验室的工具箱。

欲了解更多信息,请参见“网络研讨会”LC-MS平台是治疗蛋白质科学头痛的妙方”。

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