加速细胞系和过程开发的平台方法

细胞系发展和过程开发是成功的生物制造的关键构建块。对于细胞系发育,必须尽可能快速有效地识别高表现克隆。然而,现实是传统上,这一过程一直是劳动密集型和耗时的耗时。

克隆选择过程涉及寻找表达足够滴度的重组蛋白滴度的少量克隆,以成为生产规模的候选者。为了找到这些高性能的克隆,通常需要手动或通过自动化筛选成千上万的候选人。选择高质量的克隆后,工艺开发开始。对这些克隆和特定应用的过程优化进行了处理,也可能是耗时和劳动密集的。

由于速度升至市场,公司正在寻找简化和速度细胞系列开发和过程开发的方法。例如,确保更多地产生更多的生产克隆。此外,优化生产平台并选择在该平台中表现良好的克隆更有效,而不是构建每个克隆周围的过程。

这些领域在最近的白皮书中探讨,“加速细胞系和过程开发“。白皮书讨论了通过采用平台方法提高细胞系和工艺开发效率的方法,该平台方法包括从蛋白质序列到生产细胞系所需的所有材料。

Chozn.®和Ucoe.®联合平台加速细胞线开发

Chozn.®GS - / - 细胞系

平台的第一个组成部分是chozn®GS - / - 细胞系。介绍于2011年,它具有缺失的谷氨酰胺合成酶基因的等位基因。产生产生感兴趣基因(GOI),CHOZN的细胞系®用含有谷氨酰胺合成酶基因和GOI的质粒转染线。在培养基中没有谷氨酰胺对细胞产生的选择性压力产生整合质粒的细胞,使其能够存活。

Ucoe.®技术

第二个组件是一种表达式技术,当与Chozn结合时®细胞系,增加可用于选择的高性能克隆数。

细胞系发育依赖于表达载体的随机整合到宿主细胞基因组的正确位置,以便在选择过程中存活。基因组的特定位置,转基因整合到该基因组中,以及该区域是否由异铬胺或欧洲甜酰胺组成,在转基因的表达中起重要作用。大多数基因组被组织成紧密缠绕,转录无活性的异铬胺。相反,DNA的一部分在开放的转录活性形式中,称为Euchromatin。在随机整合期间,如果转基因整合到异象素中,则通过宿主细胞酶快速甲基化。在甲基化之后,DNA紧密地缠绕成组蛋白并不能支持转录。

UCoE®元素是DNA的一段,其源于必需内政基因的启动子的5'控制区域。该地区已经进化以防止链接基因的沉默。当转基因与UCoE相关联时®,防止甲基化,DNA保持开放并能够转录(图1)。这种在细胞系发育过程中增加率的方法已经使用了超过15年,并已纳入CHOZN中包括的表达载体®和Ucoe.®合并平台。

图1:当转基因与UCEE相关联时®,防止该区域的甲基化,DNA保持开放并能够转录。

平台性能

在白皮书中,作者研究了Chozn的能力®和Ucoe.®组合平台增加高新克隆的数量。在该研究中,转染细胞并在短暂的回收期之后,将数千个镀成96孔板并在没有谷氨酰胺的情况下培养。然后筛选所得的微池进行滴度。图2显示了UCoE的初始筛选滴度®两种细胞系开发研究中的控制微型池。每根线代表单独的小池的滴度,在96孔板上的七天分批测定中评估。微型池的平均滴度之间存在显着差异。

图2:纳入UCoE®表达载体增加了高表达微型池的数量。

随着命中率的增加,研究作者假设阐明了孤立高新克隆更容易。顶部生产Ucoe®将微型池接种用于单细胞克隆,并对那些表演克隆进行FED分批测定。图3中描绘了来自三种mAb的前三十个克隆的滴度和一个双特异性细胞线开发项目。这些结果表明了Chozn®和Ucoe.®组合平台可用于生成高性能克隆。

FIGURE 3:来自三名MAB的前三十个克隆的滴度和一个双特异性的细胞系开发项目。

稳定

为了确保顶部候选克隆的稳定性,它们暴露于表达稳定性测试。重组克隆传代至少45天;对早期通道和后通细胞进行喂养分批测定以确定保留滴度的百分比。

结果表明,在培养90天后,MAB#1的五个克隆中的每一个至少保留了至少75%的滴度。将来自MAb#3的17个表达克隆进行了45天的表达稳定性实验;这些克隆中的13个保持至少75%的早期通道表达。这支持重组Chozn的假设®和Ucoe.®组合平台克隆表现出表达稳定性。

加速过程开发

另一个重要的考虑因素是如何加快流程开发。传统上,在特定的高产生克隆周围优化了一种方法。改进此方法的一种方法是开发强大的平台过程,然后仅根据需要进行小的简单优化。在该研究中,用高产克隆进行简单的进料筛网。然后在Mobius BioreActors中缩放了该过程,以从替补席上迅速移动过程开发到飞行规模。

饲料优化

对于饲料优化研究,使用Ex-Cell的简单进纸筛查研究评估克隆®高级CHO Feed 1和Celldento®4FEED COMP。使用前细胞在旋转管中生长喂食批次培养物®高级CHO FED批处理介质。初步研究的数据表明,两种饲料的组合改善了过程性能。为了评估组合饲料,运行每种克隆的额外一组管,其中使用对外细胞开发的方案的方案以相等的部分加入每种进料®先进的饲料平台。根据需要根据需要加入葡萄糖,随着细胞密度的增加,目标浓度增​​加。

如图5所示,不同的饲料导致三种不同克隆的细胞密度和滴度的差异;重复的培养物由相同的颜色表示,具有一个实线和一个虚线。

图4:三种饲料对三种不同克隆产生MAB#1的纤维滴度的比较。

作者发现双饲料在一些测试的克隆中有益,但在每个饲料时添加两个添加步骤复杂的平台过程。幸运的是,可以将这两种特定的馈送组合并作为单单元操作组合。

下一个作者使用除50-50以外的饲料以外的混合比例进行了研究。他们发现,克隆之间的优选饲料或混合物(请参阅白皮书中的完整数据)。有趣的是,性能改善变化的机制。在一些情况下,优选的进料导致生物质的增加,其随后转化为体积滴度的增加。虽然在其他情况下,细胞密度没有明显的增加,但观察到体积滴度的显着增加,表明细胞特异性生产率的增加。

还通过在CHOZN中产生的更难以表达的双特异性分子进行了类似的研究®使用UCoE的细胞系®。在这种情况下也发现了类似的优化结果,并且在白皮书中提供了完整的数据。

生物反应器优化

下一个作者看着将过程移动到生物反应器。强大而可扩展的平台流程使得这一移动更有效并且具有更高的成功可能性。作为作者状态,这一概念的基础是,选择适合强大进程的克隆更简单,更快,而不是重新设计每个项目的特定克隆的整个过程。通过选择适合该过程的克隆,可以减少生物反应器开发时间表。如果需要,可以对现有过程达到所需的性能水平,而不是从头开始设计从头开始的过程,而是可以进行微小的调整。

为了使平台进程成功,应设置过程参数,以便它们在尺度上可翻译,这允许从长凳上快速扩展到导频并减少可能的过程开发瓶颈。这种方法能够更快的技术转让和产生材料,以支持毒理学研究或一阶段临床试验。然后可以根据项目阶段和商业化要求决定投资进一步时间和优化努力的决定。

研究作者实施了他们在所选克隆的生物反应器研究中的平台过程。首先以3升为3升的细胞密度和体积生产率评估克隆。选择顶部克隆后,将其在50升规模下评估。在3升和50升的生物反应器之间发现了可比的结果。因此,确认平台的稳健性和可扩展性。还进行了类似的生物反应器评价,用于更难以表达的双特异性。

学习外带

  • 使用chozn®和Ucoe.®具有馈电屏幕的平台和强大的生物反应器放大方法为上游生物处理需求提供了一致而坚固的解决方案。
  • chozn.®和Ucoe.®平台增加了高产克隆的命中率。
  • 在开发策略中实施进纸阶梯可以显着提高FED批处理过程的性能;许多细胞系和克隆已经证明了随着使用饲料混合物的增加的细胞密度和体积滴度。然而,重要的是确定最适合特定的克隆,因为一些更喜欢单一饲料和其他更喜欢共混物。
  • 使用一系列可伸缩的生物反应器,例如Mobius®生物反应器,将大大减少过程开发时间表。
  • 通过利用强大的平台过程,可以显着减少开发时间表,这允许快速评估生物反应器中的顶部克隆并从长凳到飞行规模快速扩展。然而,应该注意,这种方法优先于完美的速度。它可以帮助获得更快的技术转移的流程,这转化为早些时候的毒理学研究和一期试验的发电材料。然而,有方面可以优化,以进一步改善过程性能,这进一步提高了过程性能,这是在锁定第二阶段及其超越的过程中的重要性。

要查看完整的研究结果,请参阅 -加速细胞系和过程开发

把它固定在pinterest上