我们看到DNA产量非常差。你有一个很好的协议吗?

回答

为了具有良好的质粒DNA(PDNA)产率,最佳方案是具有稳健的整个过程,其中每个步骤得到很好的优化。由于其相当大的尺寸,高负电荷,粘度以及污染物对PDNA(开放圆形PDNA,基因组DNA,高分子量RNA)具有与污染物相似的事实,PDNA净化是挑战。此外,大质粒对剪切应力敏感,进一步使纯化复杂化。为了用高产率纯化超滤波器PDNA(用于治疗/转染的所需形式),需要良好优化的下游工艺。我们公司拥有下游过程的每一步的解决方案和能力,以确保最佳的PDNA产量和纯度(图1中总结)。下面讨论了每个下游单元操作的考虑和观察。

集成工作流程,具有从收获到最终填充的PDNA净化的功能
图1:集成工作流程,具有从收获到最终填充的PDNA净化的功能

细胞收获

电池收获步骤使用离心或微滤TFF。当需要处理批量卷(<10L)或更大的批量(> 1,000L)时,离心通常更具成本效益。使用离心时,在大规模离心中产生的高剪切需要特别注意。微滤可以用开放式通道进行,平板电路板(如Prostak)进行TM值与杜阿佩尔的盒式磁带®0.1或0.2μm微滤膜或颗粒®与杜阿佩尔的盒式磁带®v屏幕或生物脂®1,000 kd V屏幕超滤(UF)膜。开放式进料通道为细胞保留产生温和的流动路径,导致低剪切,并且可用于处理粘性和/或高固体进料。当使用膜截止诸如这些时,重要的是利用双泵(渗透控制)TFF系统。TFF收获步骤通常涉及2-5x体积浓度,然后在进一步下游纯化之前洗涤介质组分和细胞外杂质的3-5体积渗滤。TFF收获通常在低跨膜压力(TMP; 3-5 psi)和Δp(<7psi)下操作,并在渗透通量上进行控制。中空纤维模块也适用,但可以伴随着由于非线性可扩展性而导致的缩放问题。

微过滤TFF的典型操作参数:

微过滤TFF的典型操作参数

细胞裂解

用于细胞裂解的方法可分为两个主要类别 - 化学(碱,洗涤剂,酶,渗透休克)和生理机械(热,剪切,搅拌,超声化和冻融)裂解。碱性裂解(NaOH在pH〜12)伴有洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)和Triton®X-100是最常见的方法。重要的是优化裂解孵化时间,因为它直接影响质粒DNA的质量和量。较长的孵育时间可能导致质粒DNA的不可逆变性和基因组DNA的剪切劣化。在碱性裂解步骤上使用高效但不太侵蚀混合至关重要,以确保没有pH极值导致质粒的不可逆变性或由于过量剪切而降解。莫伊斯®单用混合器对于批量溶解非常有效。

在碱性裂解方法期间,在基因组DNA的特异性窄的pH(通常围绕pH 12)的特异性窄的pH(通常约为pH12)中处理细胞,而PDNA双链保持完整(pH范围为12.0至12.5)。最佳pH值根据质粒和宿主菌株的类型而变化。从最佳值偏差超过0.1 pH单位可能影响产率,因此在碱性裂解期间保持对pH范围的紧密控制至关重要。在pH> 12.5时,PDNA变得不可逆转地变性,如果pH太低,基因组DNA不会完全变性并且可以使进一步的下游净化过程复杂化。标准碱性裂解的孵育时间相当短,并且该步骤通常在5分钟内通常在5分钟内完成。

在碱性裂解之后,将pH中和。这通常通过添加高盐缓冲液,例如浓度为0.7m-3.0m和pH〜5-7.5的钠或乙钾进行,用/不含1.0-1.5%CaCl2(促进RNA沉淀)在洗涤剂(0.2-1%SDS)存在下。聚乙二醇(PEG)和聚乙烯胺也可以加入中和缓冲液中以促进基因组DNA的沉淀。在中和和沉淀过程中均匀混合对于维持PDNA质量至关重要。

澄清

PDNA工艺的澄清单元操作应使得能够从进料流中除去固体含量。可以通过离心和/或正常流过滤进行澄清。传统上,离心用于澄清。使用离心时,应该注意剪切应力,这可能会损害超硅化性质粒的结构,从而导致产量下降。离心也可能需要次要澄清步骤。使用正常流过滤的澄清是现代方法。当使用该方法时,可以使用饲料流,其未经处理,预处理或预制。预处理对澄清过滤器容量产生了重大影响,并且必须仔细选择,并考虑到该过程的可扩展性。预处理选择包括使用重力沉降和分离,多角形®CR1μm/ polygard®CR50μm,袋式过滤不锈钢筛过滤器,纸质过滤器和离心。多体的容量®CR过滤器通常在0.55-8升/英寸的范围内。

推荐的过滤器设置为澄清步骤是:

推荐的滤波器设置为澄清步骤是

过滤器的预期容量强烈取决于是否进行预处理:

过滤器的预期容量强烈取决于是否进行预处理

使用Clarisolve时的典型恢复®和Millistak +.®过滤器> 90%。可以使用含追含量的缓冲液来增加回收。Millipore Express的能力®SHC灭菌级过滤器澄清通常在400-650 L / m之间2

切向流过滤(TFF)

澄清后,可以选择TFF步骤。这将允许渗透和执行渗滤以将培养基交换为适于下游色谱步骤的缓冲液。通过在色谱前进行浓度,可以减少色谱负载时间。此外,在TFF期间可以除去RNA,小尺寸的基因组DNA和小蛋白质,这也有助于防止色谱树脂污染。

执行TFF时,一些关键钟表是:

  • 质粒的剪切敏感性,需要仔细调整过程参数,以防止对质粒损坏。
  • 膜污染,导致产量损失。
  • 高盐缓冲液促进质粒压实,这可能允许通过小孔,导致产率损失。

可以通过仔细筛选推荐的开放频道膜,例如PELLICON来避免这些问题®2 Ultracel.®或生物脂®100或300 KDA C屏幕。通过使用开放通道,可以减少剪切应力。另外,通过适当的膜尺寸最小化处理时间是重要的。当使用这些更宽的膜截止时,通过利用双泵(渗透控制)TFF系统来控制渗透通量非常重要。这将有助于防止膜污垢。

典型的TFF工艺参数是:

典型的TFF工艺参数

色谱纯化

对于色谱纯化,通常使用AION交换色谱(AEC)和疏水性相互作用色谱(HIC)。已经实现了两种技术用于捕获或中间纯化/抛光,并且通常组合。

使用AEX作为PDNA的捕获步骤时,刺破澄清的裂解液与NaCl(120-250mm)有益。这将消除RNA的干扰,从而增加了PDNA的结合能力。补充的最佳盐浓度需要预先确定,例如通过微量滴定板形式的分批测定,测量在增加氯化钠浓度下的质粒结合能力。对于不同类型的树脂/膜吸附器可以这样做。以下图表展示了Fractogel的这一原理®EMD DEAE(M)和Fractogel®EMD DMAE(M)树脂:

Fractogel®EMDDEAE(M)和Fractogel®EMDDMAE(M)树脂
(补充前的原始裂解物:pH 5.0,67 ms / cm)

推荐的质粒纯化树脂及其各自的性能:

推荐的质粒纯化和各自的性能

由于质粒的大尺寸,通常在市售树脂上观察到低结合能力。这是由于大多数AEX介质最初设计用于蛋白质纯化,因为质粒分子大于蛋白质,它们不能进入小孔,导致低结合能力和慢重传递。因为Fractogel.®和eshmuno.®树脂含有触手技术,通常可以实现与其他可用树脂相比更高的粘合能力。natrix.®Q基于膜技术并含有大型对流孔隙。后者促进了传质并改善了结合容量(5-10mg / ml)。由于膜技术,需要非常短的停留时间(<0.2分钟)。由于这些优点,以及其单一使用格式,它已被广泛采用。

上表中提到的所有四种树脂可用于捕获PDNA。但是,只有Fractogel®EMD DEAE(M)和Fractogel®由于其中等胎圈尺寸(D50:48-60μm),因此,EMD DMAE(M)树脂非常适合于中间纯化或质粒DNA的中间纯化或抛光质粒DNA,以及良好的分辨率(D50:48-60μm),清除像RNA等残留的杂质和内毒素有效。

HIC树脂的实例是CAPTO™质粒选择和TOYOPEARL®丁基。HIC步骤可以位于AEX步骤之前或之后。当HIC步骤是第一色谱步骤时,洗脱液可以直接加工到Fractogel上®作为与这些AEX树脂结合的PDNA结合,耐受升高硫酸铵浓度(PDNA结合能力而不会受到带负面影响的存在)。

Natrix的实验运行示例®Q色谱膜捕获PDNA:

用于捕获PDNA的NATRIX®Q色谱膜的实验运行的实例

最终浓度和灭菌级过滤

色谱后,将样品浓缩并在选择的缓冲液中渗滤。如切向流动过滤部分中提到的相同条件适用。

由于最终产品的大尺寸和粘度,PDNA的无菌过滤可能是挑战性的。此外,大质粒可以是剪切敏感的并且在操作期间可能被损坏。一些关键考虑因素是:

  • 盐浓度:在增加盐浓度时,质粒DNA趋于更紧凑。后者可导致提高产量和过滤能力。
  • 膜型:通常,在使用基于PE的膜时,可以实现更高的过滤器容量和磁通。基于PES的膜也可能对较大的质粒(较少剪切)造成损害。Millipore Express®建议使用SHC进行此操作。
  • 质粒纯度:与开口圆形质粒相比,超硅化性质粒倾向于提供更好的过滤性能。因此,产量和过滤能力均倾向于随纯度而增加。
  • 定义过滤终点:发现表明膜污染与产量损失相关。优化过滤端点可能导致产量增加。
  • 饲料通量或压力不会显示对过滤能力或产率的显着影响。然而,应避免高驱动力以降低潜在的剪切应力。

纯化PDNA灭菌级过滤的预期性能:

推荐的质粒纯化和各自的性能

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