酷炫的工具–快速而稳健的AAV特征描述

腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)载体是目前应用最为广泛的基因传递系统,它能有效地将有益的遗传物质转移到具有低致病性的分裂和非分裂细胞中,并能灵活地定向于不同的组织类型。由于病毒载体在细胞和基因治疗中的应用,管理机构对病毒载体制造商的要求很高,期望进行广泛的产品特性分析,以确保产品的安全性和有效性。FDA的化学、制造和控制(CMC)指南指出,制造商必须证明其病毒载体的特性、强度/效力、纯度、安全性和稳定性。

AAV制造挑战

在制造AAV载体方面,一个主要挑战是,空壳或部分衣壳的形成不包含预期的遗传序列,以发挥治疗效果。这些不需要的载体相关杂质有效降低了效力,影响载体产品的纯度,甚至可能给患者带来安全风险。因此,AAV载体必须通过比较序列特异性基因组效价与总衣壳滴度和总DNA的数量来充分表征。

需要更好的分析工具

准确测定AAV衣壳滴度、衣壳含量(空/满比率)、总DNA和蛋白质含量以及AAV聚集的存在的分析工具可以帮助制造商更好地了解其载体产物并优化其工艺,以生产更高纯度、更有效的AAV用于治疗用途。目前的定量方法包括正交技术的组合,如分析超速离心(AUC)、透射电子显微镜(TEM)、基于PCR的方法(即qPCR和ddPCR)和比色分析,如酶联免疫吸附试验(ELISA),以估计AAV蛋白和基因组滴度以及衣壳含量。然而,长时间的实验、可变的检测灵敏度/准确度和破坏性采样极大地影响了它们在需要近实时结果的过程优化和质量控制分析中的应用。特别是,在进行病毒载体制造优化的过程中,有限的样本量和检测AAV参数的细微变化需要具有灵敏度、再现性和吞吐量的技术,以时间敏感的方式生成可操作的数据。这些挑战凸显了在这一领域需要更好的分析工具。

眩晕仪及其96孔自耗板
图1:眩晕仪及其96孔自耗板

特技器可快速全面地描述AAV

特技是其中之一。它利用紫外/可见光谱(230-750纳米)结合动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS),以实现快速和全面的AAV特性。该仪器在230–750 nm和0.03–275 OD范围内进行紫外/可见光谱分析,用于准确测量量化蛋白质,DNA和RNA许多常见实验室样品的浓度。对于AAV样品,存在的蛋白质和DNA的比率与空/满衣壳的比率有关。然而,光是光谱数据还不足以确定有多少蛋白质和DNA被包装到AAV衣壳中,为此,我们结合了光散射技术。动态光散射(DLS)测量粒子在布朗运动下随时间散射的相对光强度,提供粒子的大小、大小分布和聚集状态等信息。DLS通常与静态光散射(SLS)结合使用,后者基于Rayleigh光散射原理,其中光散射强度与粒子浓度成正比。188jinbaobo

特技板中的每个井都包含一个微流控电路
图2:在特技板中的每个井都包含一个微流控电路,其中测量UV/Vis、DLS和SLS数据。

将DLS和SLS数据结合起来,可以洞察粒子浓度,但这一答案仍然取决于衣壳散射光是空的还是满的,因为全衣壳散射的比空的要大。当UV/Vis、DLS和SLS数据集合并时,Stunner'sAAV数量该算法具有足够的信息来计算载体基因组滴度、衣壳滴度、空/全衣壳率和任何AAV样本的聚集状态,而不考虑血型。

将DLS和SLS数据结合在一起可以深入了解粒子浓度
图3:Stenner的AAV定量应用程序计算(从左上角顺时针方向)大小和聚集、总DNA和蛋白质、空/全比、载体基因组滴度和衣壳滴度。

该平台采用96口SBS兼容板。每个井都通过微流控电路连接到2个微UV,固定路径长度为0.1和0.7mm,可精确地捕捉样品的吸光度,并跨越广泛的动态范围。分析只需每口井2μL的样品量,平均运行时间为1小时/板(96个样品)。Stunner还与机器人自动化平台兼容,以实现更高的吞吐量和大容量采样要求。

与基于PCR的AAV定量方法相比,Stunner提供了一些优势,这些方法使用序列特异性引物来针对AAV基因组,这可能会错过未被适当引物捕获的DNA。特技剂可以在所有AAV血清型和不同的基因插入物中工作,无需对每个AAV进行引物优化。由Stunner产生的衣壳滴度结果也与已建立的ELISA技术密切相关,其中空空和全AAV的衣壳滴度显示R2.值>0.98,斜率接近1,表明这两种方法之间高度一致。但是,由于Stunner的技术不需要标准曲线生成或样品标记,它需要比ELISA更少的准备时间来更快地为科学家带来准确的结果。

该技术在无需昂贵的样品制备、校准和其他技术所需的技术资源的情况下,以规模快速、全面、低体积的AAV表征,满足下一代分析工具的要求。从而使其成为早期、高通量筛选的完美解决方案。平台性能符合USP和Eur。标准和配备了符合21 CFR第11部分的GLP就绪软件,这使得制造商能够在开发和生产的所有阶段灵活地使用特技器。它还消除了在商业化之前需要技术升级和重新验证程序。通过适当的技术和程序进行商业化规划,使公司能够以最快的速度向市场发展。

有关Stunner的更多信息,包括访问应用说明、网络研讨会和演示,请访问:https://www.unchainedlabs.com/stunner/

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