快速花费在细胞系开发期间代谢物的媒体分析,以更好的产品质量结果

媒体分析是用于提供关于细胞在生长阶段使用的氨基酸和营养素的重要信息的重要工具。花费媒体分析还提供有关细胞生长产生的代谢物的细节。这对细胞系和流程开发团队有用,因为它提供了在文化期间可能发生的媒体构成性能,最佳收获时间和产品质量变化的数据。

Elsa Gorre博士,BiothyApeutics Development,Janssen Research&Development,在ASMS年会上就这个主题提供了非常丰富的谈话。The talk, “Analysis of Spent Media Metabolites on the SCIEX QTRAP® 6500+ LC-MS/MS System to Assure Product Quality During Cell Line Development for Biologics,” described in detail Janssen’s implementation of spent media analysis via mass spectrometry as part of their clone selection process. They were able to verify sequence variant misincorporation and to monitor the amino acid and metabolite profiles of different clones. I have summarized the highlights of the talk in this article.

花媒体分析目的

Gorre博士通过解释她的团队的媒体分析工作的目的开始讲话。它们主要有兴趣监测氨基酸和代谢物的日常变化,以优化克隆的生长条件,促进高细胞活力,最大化滴度的产生,确保高产品质量,减少或消除序列变异的MISLIND。她说,詹森专有媒体开发团队不断修改培养基的组成,以最大限度地减少必需氨基酸的耗尽,并且它们正在使用建模方法来实时预测氨基酸和代谢物趋势。

该团队还使用Chent Media分析来验证序列变体。序列变体(SVA)是氨基酸序列的意外变化,这可能会影响最终产品的疗效,安全性和免疫原性。SVA的原因包括通过复制误差或DNA损伤和mRNA误读事件的DNA突变,包括密码子误读(最常见的)或TRNA错误充电。

花了媒体分析挑战

Gorre博士然后描述了细胞系开发集团的抽样过程,并分享了对花媒体分析的挑战的观点。她引用样品制备(具体提取方法),只需使用一种方法(即氨基酸与维生素与营养物质)分析不同类别的分析物,以及不同分析物的浓度的大范围。解决这些挑战,该团队使用NMR技术进行了比较提取方法。对于样品,它们施加丙酮腈代谢物方法的提取和样品两种,它们施加甲醇代谢物提取。结果表明,代谢物在两种提取方法之间具有10-20%的浓度差异。

预定多次反应监测增加MRM方法效率

该团队还探讨了来自SCIEX的预定的多反应监测(MRM)算法。它们旨在通过将分析物利用率最大化与预定的MRM来提高MRM方法效率。

他们发现,MRM计划提高了以下方式:

  • 每个MRM仅监控其预期的洗脱时间
  • 同时下降MRMS.
  • 维持循环时间和停留时间
  • 每种分析物增加有效占空比
  • 保持分析精度

在比较普通MRMS与预定的MRMS时,他们找到了:

  • 普通MRM导致峰值采样差,使得强大的峰积分非常困难
  • 预定的MRM提供了适当的循环时间,可获得良好的峰值取样,并从12%到7.8%的CV增加测定再现性

使用SCIEX预定MRM方法工作流程与SCIEX合作

Gorre博士然后讨论了与Sciex的合作,以监测细胞培养和使用Sciex的目标计划MRM方法的Cell Culture和Chent Media的组件和代谢物。

用于分析媒体组件的仪器包括:

  • exion lc™系统实现高效分离
  • Phenomenex Kinetex.®F5列以分离各种复合类
  • Qtrap.®6500+ LC-MS / MS系统快速扫描和极性切换 - 大动态范围高达6倍
  • 预定MRM™算法Pro以优化循环时间并最大化停留时间。

虽然它仍然是合作的开始,但是已经将用于花费媒体分析的样本发送到SCIEX,并在EXION LC™系统上进行分离,具有现象Kinetex®F5反相色谱柱。他们发现它们能够将样品分离成不同的类别,即代谢物,维生素和氨基酸。例如,它们在花培养基分析中分离半胱氨酸与半胱氨酸的困难,但是它们能够分离这两个kinetex f5反向相柱。

用于废媒体分析的亲水性相互作用色谱(HILIC)

Next Gorre博士描述了一种培养介质分析的另一种方法,亲水性相互作用色谱(HILIC)。它们目前正在使用预先生物MS花介质HILIC柱,其具有粘合到过孔多孔二氧化硅颗粒上的两性离子相。188jinbaobo

她解释说,SCIEX方法可以测量111分析物,但现在它们只是监视约40分析物的子集。他们正在收集数据的小组决定监控的分析物的数量。目前他们正在监测40分析物的浓度(代谢物和所有20个氨基酸)。修改列表由在正模式下监视的30分析物组成,并在负模式下监视的10个分析物组成。组合使用预定方法监视超过80个转换。然后,她在HILIC色谱比较标准与样品上共享数据。在标准中,它们看到了很大的分离和极大的反应,而在样品中,这些峰的强度范围是巨大的。她的结论是说仪器的动态范围对他们的工作非常重要。

数据处理软件

Gorre博士表示,他们目前正在使用Sciex OS-Q(SCIEX OS Analytics)软件,用于PCA的全球样本比较全球样本。它们将使用该软件量化和比较BioTherapeutics生产中的组件。现在他们期待着使用这些来对数据进行统计分析。

然后,她呈现了外部校准曲线的示例,并表示系统非常好,并且它们能够为它们正在监测的所有40个代谢物生成校准曲线。

特定分析物监测

Gorre博士发现的一个分析物对于监测是乙醇胺非常重要的。她分享了一种游离乙醇胺存在于细胞介质中,并且在细胞增殖中至关重要。它是磷脂酰乙醇胺(PE),PE是细胞膜中的主要磷脂。乙醇胺缺乏导致膜的改变的磷脂组合物,其影响生长因子信号。它涉及营养储存和运输,以及信号转导。

Gorre博士和她的团队跟进丝氨酸和乙醇胺趋势。他们发现最初乙醇胺非常高,但在第5天的乙醇胺下降并且存在缺乏。他们发现,因为丝氨酸的脱羧产生乙醇胺,即在第5天耗尽后,细胞能够在耗尽后“创建自己的”乙醇胺。结果,在第7天也耗尽。

用于监测的另一个重要代谢物是胆碱。乙醇胺的甲基化导致胆碱。胆碱对于细胞膜的结构完整性是重要的,因为它用于合成其他磷脂。胆碱在细胞信号中也很重要,因为含有磷脂是细胞内信使分子。最后,胆碱是甲基的主要来源。在监测胆碱中,他们发现它在文化中开始高,但在第9天耗尽。

病例研究 - 将氨基酸的耗竭与使用废媒体分析观察到的序列变体

这项工作领导了Gorre博士和她的团队寻求氨基酸和序列变体(SVA)的耗尽之间的相关性。她开始描述Janssen的克隆选择过程。Janssen选择15个克隆来监测,并创建一个不同测量的表,这些测量结果在培养方面的16天内使用。它们测量滴度(收获值)和百分比的活力。他们的质量规范仔细看了产品质量,特别是主要的序列变异和糖化百分比。他们的CD分析组看着碎片,占聚集百分比,单体和纯度。

该团队使用肽地图来识别序列变体。它们的SVA阈值为0.1%,在其中没有报告。在案例研究中,他们发现了一个主要的SVA - C93Y,其中93位的胱氨酸实际上是添加的酪氨酸。他们发现几个克隆显示出相同的序列变体,但在不同的水平。这证实了SVA不是由DNA突变引起的,因为当它是DNA突变时,它们仅在一个或两个克隆上看到它。

序列变体与氨基酸耗尽的相关性

在收获材料上获得序列变体分析。他们将克隆的趋势图与没有SVA的SVA和克隆进行了比较。趋势图显示了枯萎病和酪氨酸的耗尽的时间点。他们发现胱氨酸在第9天耗尽,酪氨酸水平是一致的,直到它们在第9天下降,同时胱氨酸用SVA滴在克隆中。这表明培养基中的酪氨酸被耗尽,并加入单克隆抗体的氨基酸序列中。然后,由于每隔一天递送的胱氨酸和酪氨酸饲料,胱氨酸和酪氨酸的水平增加了过去的第11天。没有SVA的克隆没有胱氨酸或酪氨酸的下降。

结论

Gorre博士得出结论,使用SCIEX系统使用SCIEX系统,在20分钟的LC-MS运行中允许使用SCIEX系统进行不同类代谢物和氨基酸的定量测量。它提供了一种快速的方法来同时分析110多种分析物,并监测每分析物的2或更多转变。

它们正在将该废媒体分析实施,作为其质谱克隆选择包的一部分。此时对它们最重要的用途是为了验证在肽图分析中观察到的序列变异的misclations。它们还在监测不同克隆的氨基酸和代谢物轮廓,并正在考虑使用统计方法来寻找与滴度值相关的趋势。

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