询问专家 - 使用空气液面界面的疾病模型推进呼吸系统疾病研究

Audrey Bergeron.是康宁生命科学的应用科学家。她评估了新产品,并使用康宁细胞培养产品制定协议和技术文件。她为康宁员工和客户提供产品培训。与康宁科学支持团队合作,她也与客户携带,以帮助解决他们的研究。

Shabana伊斯兰教,博士支持康宁生命科学的全球商业渗透性支持业务。她于2009年以来一直在康宁,她以前曾担任过高级科学支持专家。在她目前的角色,她与跨职能团队密切合作,以推动渗透性支持的收入增长,确定客户需求并翻译客户的声音,以及写入技术文件。她的博士后经历是细胞和分子生物学,在那里她在不同的研究领域工作。她抱着大师和博士。来自印度Aligarh穆斯林大学的生物化学学位。


空气液体界面(ALI)是研究呼吸道上皮细胞的理想选择,因为它使培养物的一侧暴露于液体介质并用空气围绕另一侧。因此,与使用常规细胞培养模型相比,ALI系统允许研究人员更准确地模仿体内条件。这使得它们成为对药物渗透屏障进行呼吸上皮细胞的机械研究;模拟呼吸疾病,如囊性纤维化和哮喘;研究伤口愈合等必需的皮肤过程;并推进对呼吸上皮感染的理解,包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-COV-2)。从哮喘到COPD,ALI模型对于研究呼吸系统疾病至关重要。随着近期爆发和Covid-19病毒的严重程度,这种技术在竞争中变得更加重要,了解和治疗疾病。

随着这些更复杂的模型的普及,我们已经组装了一支专家团队来回答你的疾病建模问题,使用ALI工具和系统。

本次会议不再提交意见书。被通知的新询问专家会议,加入我们的188官方网站邮件列表

问题1

您建议使用什么样的文化用品(ALI)培养物?

当产生空气液体界面或ALI培养物时,您需要创建一个可以通过微孔膜分开的双隔室模型,例如Transwell®,Falcon®或Biocoat®可渗透的支持

在通常涂覆的可渗透支撑件上进行ALI研究胶原蛋白类型I,IV型或胶原蛋白类型I和III的组合。研究人员可以使用预涂层的渗透支撑,如康宁生物透露胶原I细胞培养刀片或选择涂覆涂层本身。透过的支撑件具有0.4μm的孔径常用于Ali研究,尽管也可以根据应用使用其他孔径插入物。

关于文化软件的选择,它将取决于最终用户的应用程序。例如,如果您正在增长3D有机型皮肤等效模型,则更大的尺寸格式,例如6井可渗透插入100毫米菜或矩形托盘最适合。而for.与药物筛查有关的研究,使用HTS格式,例如96良好的渗透性支持将是理想的格式。这24孔渗透支撑是最常用的格式之一,尽管仅基于最终用户的应用程序使用12孔或6孔格式。多井伴侣板,如Falcon®6-井深井盘子,是长期培养解决方案,可以降低媒体变化的频率,节省劳动力,并尽量减少污染风险。康宁提供A.可渗透的支持选择指南通过如何选择最适合您的应用程序的膜式,孔径,格式和表面处理。

问题2

您能分享您了解的任何研究,它使用Covid-19研究的空气液面界面吗?

阿里模型扩大了科学家的理解,导致Covid-19。在同行评审期刊上发表了许多研究,还有几个即将到来。

康宁已经编制了一个Transwell渗透支持的引文摘要在空气液体界面上研究Covid-19以及发布的应用笔记人体气道上皮细胞培养和Covid-19研究。冠状病毒相关和Covid-19相关的文章,包括使用ALI研究的文章,也可以在公共储188jinbaobo存库中获得,例如穿过NIH国家医学图书馆

关于用于Covid-19研究的ALI的任何研究,康宁组合在一起的引文摘要突出了最近最近的一些出版物,其中Transwell可渗透的支撑物用于ALI研究离体模型和这些研究证明了Transwell可渗透的支持作为研究冠状病毒感染和靶向疗法的发展的有效工具。

事实上,第一个出版物之一新英格兰医学杂志在Covid-19 Pandemer开始后,突出了从康宁的翻转渗透支撑件以获得ALI模型。在该模型中,研究人员对来自患者的样品的样品和随后的病毒感染的病毒感染患有病毒感染,以及随后将人呼吸道分泌物的病毒感染培养的人气呼吸道细胞培养到人气通道上皮细胞培养物中以鉴定受感染患者的病毒颗粒188jinbaobo。

上述引文概述涵盖了可以使用ALI模型的各种方式 - 从机械研究到哪种分化的上皮细胞类型为例如纤毛的冠状病毒靶和冠状病毒复制到Covid-19上的药物复合效力的研究菌株,以及药物组合疗法对Covid-19的影响。

列出的一个引用3D肺泡有机体模型和ALI培养物代表了一种高度相关的临床前工具,以评估SARS-COV-2感染和复制,并作为药物筛查和验证的平台。

问题3.

在使用ALI模型时,我读到了人们遇到了实现人口倍增的困难。应该在优化的文化中预期什么样的倍增,您有任何建议是否达到这些数字?

人口加倍是依赖于细胞类型的东西,因为每个细胞类型都有自己的生长速率模式,这可能会在可渗透的载体上变化,特别是如果没有优化条件。由于阿里是长期(最多几周或几个月)培养,在进行实际的ALI培养之前,文化应该优化其特定细胞类型的初始细胞播种密度和培养时间。通常,细胞在顶端室中播种,在顶端和基石室中的介质,并保持在生长培养基中,直至它们达到所需的细胞汇合。

所需的细胞汇合是获得形成紧密结的单层细胞所需的汇合。实现所需汇合的时间依赖于细胞类型和播种密度,并且一些原代细胞类型可能需要更高的细胞种子密度或更长的培养时间。涂层的量和类型(例如,胶原蛋白型大鼠尾部)也可以影响细胞形成单层的能力,并且如果没有实现所需的汇合,则可能需要优化。有几种方法可用于确定何时已经实现了细胞单层,但最常用的方法是采用TRANSEPITHELIAL电阻(TEER)测量。典型的人格值因细胞类型而异,可以在ALI文献出版物中找到。另一种较少的常见方法是将细胞染色ZO-1等紧的结标记蛋白。

当达到所需的细胞汇合时,细胞被空气提升,这意味着从两个腔室中除去生长培养基,并且基舷室填充有分化介质。本应用笔记中突出显示了该协议的示例,“使用初级人支气管上皮细胞的空气液体界面模型的开发,来自康宁的HTSTranswell®-24可渗透支撑件”。

问题4.

您推荐哪些组件用于优化的媒体,岩石抑制剂等?

介质的选择应该是细胞类型和应用依赖性。通常,在播种可渗透支撑件之前需要生长培养基,并且在渗透载体上进行细胞生长。当在可渗透支撑件上达到最佳电池汇合时,需要基石室中的分化介质来实现ALI。有商业上可获得的细胞膨胀和Ali培养物。例如,Pneumacacult™-EX培养基血清和BPE-和BPE-培养基,用于扩增原发性人气气道上皮细胞,PNEumacacult™-Ali中等血清和无BPE-和BPE-and培养基,用于在空气液体界面培养的人气道上皮细胞作为氢化鞘等补充,都可以从StemCell技术获得。康宁的科学家在使用肺炎群中使用肺炎培养基和加入培养基的补充肝素的肺炎培养基,对原发性气道模型建立进行了经验。

如果您正在使用干细胞(例如,IPSC,有机体),您需要在渗透培养介质中包括渗透介质中的岩石抑制剂,因为您可以在单细胞传播时播种。对于网络上可用的特定细胞类型,对于特定的媒体组件要求是一个很好的资源。

问题5.

您可以提供更多关于分化和传输细胞的更多细节,从扩张到差异化吗?

当在空气液体界面(ALI)中培养时,原发性气道上皮细胞和一些上皮细胞系,例如CALU-3可以偏振并形成含有基底细胞的副分层上皮,以及柱状粘液分泌脚卵细胞和纤毛细胞。支气管上皮分化模型还含有立方形俱乐部细胞。分化过程依赖于通过存在Ali提供的环境提示,将细胞附着在基底膜提取物(BME)上的附着,例如胶原,紧细胞连接和培养基的组成。细胞首先需要在BME涂覆的渗透载体上浸没在生长培养基中,以形成具有紧密细胞连接的单层。然后,除去生长介质,并且仅添加微分介质仅加入可渗透的支撑系统的基底间隔。通过使用分化培养基进行3-4周的规则培养基改变细胞。在分化期的2-3周内,可以观察到肉桂酵母,并且脚杯细胞开始分泌粘液。一些协议建议用缓冲器漂洗顶端室,例如Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(PBS),以防止粘液积聚在细胞的顶端侧。

问题6.

您培养了哪种类型的气道上皮细胞,您有可能分享的协议?

以下是其中一些康宁技术文献的链接,包括工作流/协议。

问题7.

您应该期望在扩展期间预期有多少段段落?

您应该期望在扩展期间期望的段落数将是依赖于小型气道上皮细胞的细胞类型。如果您使用的是市售的单元格,则供应商通常提供最大数量的预期人口倍增。例如,LONZA通过15名人口倍增,保证他们的冷冻保存人的气道上皮细胞。您需要在创建工作细胞库存所需的最小细胞通道之间找到平衡,并且在渗透支撑播种之前未达到细胞群倍率。对于涉及许多条件的研究,使用较小的渗透性支持格式,例如康宁HTS Transwell-96可渗透支撑可以帮助最大限度地减少您学习所需的细胞数量。

问题9.

您是否需要不同的扩展和差异化媒体来培养这些模型?

是,需要不同的扩展和差异化介质来培养这些模型。例如,未分化的气道上皮细胞最初在细胞培养皿容器中膨胀,用于使用细胞生长培养基的几个通道。通常建议在达到60-80%汇合时收获细胞。然后将细胞接种到多孔插件上并膨胀,例如Transwell,Falcon或Biocoid渗透支持通常涂有胶原蛋白I或其他胶原蛋白类型。将膨胀介质添加到插入件的顶端和基底外侧,含有生长因子(例如,BFGF)以促进细胞粘附和生长。在市售的气道上皮生长培养基中,这些生长因子通过牛垂体提取物(BPE)的存在提供,例如通过LONZA的支气管上皮细胞生长培养基或小型气道生长培养基,或由人类等离子体衍生的组分如下Pneumacacult™-ex培养基或Pneumacacult™-Ex加媒体。

一旦细胞形成了紧密的单层,就可以从两个隔室中轻轻地除去膨胀培养基。对于细胞分化,然后将诸如Pneumacacult™-Ali培养基的培养基加入基部隔室中,仅留下暴露于空气(空气提升)的电池的顶端表面。

问题10.

获得差异化的完全功能模型通常需要多长时间,并且您可以在文化中保持型号可行多长时间?

它取决于所使用的细胞的源种和疾病状态。例如,时间量可以取决于你是否使用新鲜分离的主要细胞或市售的细胞以及是否已经冷冻保存。这可能会影响细胞在建立ALI之前形成紧密单层所需的时间。一旦细胞被空气抬起,就会产生完全分化的假衰减性上皮,通常需要3-4周。培养基和渗透性载体涂层也可以影响该时序。例如,当在胶原蛋白的空气液界面(Ali)上使用人气气道上皮细胞时,I-涂层Transwell插入物使用Stemcell Technologies的肺活量和Pneumacacult Ali培养基,在4-5周内产生完全分化的假期增生上皮。

至于您可以再次将模型可行的模式再次保持在文化中,这取决于细胞类型和来源。例如,市售的Ali型号可以有很长的一生(3-12个月)。长期维护文化依赖于常规媒体变化和使用良好的无菌技术,以确保污染未引入。商业ALI人类气道模型的例子包括由Mattek Corporation开发的Epiairway,以及来自Epithelix的Mucocilairtm和Mucilartm。

该信息特定于渗透支撑件上的气道上皮细胞的空气液体界面培养。有机体模型也越来越多地用于建模人类气道。有机体气道模型的参考可以找到这里

把它固定在pinterest上