使用转座酶以高,可预测的表达和稳定性产生克隆

标准的细胞系开发工作流程包括转染,然后筛选数百至数千个克隆,努力寻找高产的克隆菌落,稳定,并显示基于产品规格的特定属性。在克隆分离阶段,一些方法利用原位荧光检测,试图从前端拉出最好的蛋白质分泌物。

我很高兴分享下面的博客,它提出了确保分离高产无性系的另一种解决方案——转置酶。我很幸运能够就作者的文章采访他,并提供了嘉宾博客后我们谈话的文字记录。

消除细胞系发育克隆分离阶段的荧光方法:范式转变

Solentim首席商务官伊恩·泰勒博士的客座博客

早在初夏的时候在哥本哈根ESACT在整个活动中,由世界各地实验室的顶级科学家们展示的高质量的海报会议再次给我留下了深刻的印象。

然而,有一个方面让我感到惊讶,并激发了我写这篇博客的主题,那就是大量的海报描述了在他们的研究中使用荧光促进克隆分离,以获得潜在的最高产量的克隆。

在涉及细胞系发展的众多人员中,无疑有误认为是,在转染后,需要筛选成千上万的克隆以识别是高生产商的小型子集。该原理是使用荧光检测,具有标记的抗体或肽,可以在单细胞阶段非常​​早期检测和随后分离出来的细胞产生最高量的抗体(或任何产品)。该方法基于如下所示的随机插入克隆的典型克隆分布(图1)。在此图中,高生产商仅代表群体的一小部分,如绿色框中所示。

图-1随机积分的克隆分布
图1随机积分的克隆分布

筛选“金块”高生产商荧光的概念并不是新的;在2005年在Genetix工作时,我和同事恰恰是这种目的的克隆人和同事。将克隆百分子的细胞在半固体培养基中分离,然后随着这些增长和分泌的抗体进入培养基,使用荧光标记的二抗检测和“拾取”高产生克隆。

然而,它后来显而易见的是,这种方法存在巨大的缺陷,并且存在使用荧光检测的当前方法的缺陷。即,与摇动介质中的膨胀克隆的最终生产率相比,单细胞阶段的荧光之间存在缺乏相关性。实际上,荧光只是消除了不生产的克隆人群(在屏幕中不荧光)而不是识别高生产商。对于生产者来说,在单个细胞隔离阶段的生产率的任何排名都根本不会转化为文化的生产率性能。

在我看来,现在至关重要的是“敲鼓”一种不同的方法来改变细胞系发展的动态流程。这种方法是使用转置。通过巧妙的载体设计和靶向基因整合,有可能创建一个群体,其中大多数克隆的GOI插入特定位点,产生高、可预测的表达和稳定性克隆。一些制药公司,如辉瑞,有他们自己的专利方法,使用含有“着陆垫”的载体来实现这一目标。然而,转置提供了一个极好的商业替代方案。

Solentim最近与亚- 提供转座酶活性的一家公司(Leap-In™)。此处的游戏更换者是转座酶将克隆分布稳定地转向高生产克隆;例如,在下面的图2中,62%的克隆显示在第一个四分位数以进行生产率。

图-2跨越转座酶(ATUM)介导的稳定整合的典型克隆分布
图2:跨越转座酶(ATUM)介导的稳定整合的典型克隆分布。在这个例子中,62%的克隆是第一个四分位数

在实际操作中,这完全消除了使用荧光进行克隆分离的任何理由,因为大多数克隆从转染将天生是高生产者。因此,成功的细胞系开发的唯一要求是一个高效、可靠的单细胞隔离和文档系统(如vips.)。这种转座酶方法的额外益处是克隆还表现出高固有的稳定性,因此取下临界路径的稳定性研究(节省更多时间)。

龙沙的GS piggyBac™转座酶进一步证实了转座酶的影响。

细胞系开发小组的关键信息是要明白,试图分离顶级克隆的荧光分析法是一种过时的方法,它提供了生产者和非生产者的二元结果。相比之下,使用转置是快速,容易,只需要少数盘子一个完整的项目。了解更多关于转座酶和vip在细胞系发展和生物治疗中的作用在这里。请做取得联系有任何关于我们的产品或转置的问题。

专访Solentim首席商务官伊恩·泰勒博士

为什么你认为荧光检测仍然用于克隆分离,正如你所描述的,有其他可用的技术?

我认为它是由进入该领域的新群体造成的,该领域不熟悉Clonepix的历史经历和采用这种方法的实用工作流陷阱。

你能总结一下你认为转置酶方法的关键优势是什么吗?

简单,您可以在少量的板中完成整个细胞系开发项目,而不是使用随机集成的数十块板。来自这种方法的克隆也具有本质上非常稳定。

你认为使用转置酶方法与荧光检测相比节省的时间是多少?

很难说,因为两者都应该产生含有大量产生蛋白质的克隆的培养皿。通常,对于一个基于荧光分离克隆的系统,其缺点是非常高的初始资本投资成本和持续的检测试剂成本。我要指出的是,荧光分析法在克隆分离后的下一阶段仍然有用,用于测定克隆和扩增板中的蛋白质生产力。

你能告诉我们一些关于转座酶方法如何与细胞系开发中的vips耦合的更多信息,也是这种方法的好处?

转座酶并不是专门耦合到vip,这只是我们对克隆和转染阶段的建议。在工作流程方面,VIPS通过在平板的大多数孔中给予单个细胞隔离,确保了较高的播种效率,并且通过转位酶方法,大多数单个克隆将是高产克隆。结果是,你可以达到你的项目目标数量的高产克隆仅用少量的盘子。

更多信息,请参阅细胞系开发工作流程

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